Введение
1. Материалы 55
1.1. Химические реактивы и ферменты 55
1.2. Буферы 56
1.3.Среды 56
1.4. Бактериальные штаммы, векторы и плазмиды использованные в работе 57
1.5. Принадлежности и приборы 58
2. Методы 60
2.1.Методы генной инженерии и микробиологии 60
2.2.Выделение и очистка белков 67
2.3.Выделение и очистка РНК. 69
2.4. Определение концентраций нуклеиновых кислот и белков. 72
2.5. Получение и анализ РНК-белковых комплексов in vitro 74
2.6. Получение и кристаллизация РНК-белковых комплексов 75
3 . Получение и кристаллизация рнк-белковых комплексов для структурных исследований 76
3.1 .Конструирование фрагментов мРНК. 77
3.2 Клонирование генов специфических фрагментов мРНК. 81
3.3. Получение фрагментов мРНК в препаративных количествах. 83
3.4 Определение сродства фрагментов мРНК к рибосомному белку 84
3.5. Выделение и очистка рибосомных белков Ы 85
3.6. Приготовление комплексов LI-РНК для кристаллизации 87
3.7. Кристаллизация РНК-белковых комплексов белка L1 со специфическими фрагментами мРНК 88
3.8. Структура комплексов MjaLl-мРНК и TthLl-мРНК. 90
3.9. РНК-белковое узнавание. 93
4. Получение мутантных форм белка ы с измененными рнк-связывающими свойствами 95
4.1. Стратегия сайт-направленного мутагенеза. 98
4.2. Тестирование термостабильности. 98
4.3. Взаимодействие мутантных форм белка Ы со специфическими фрагментами 23SрРНК и мРНК. 99
4.4. Кристаллизация мутантных форм белка MjaLl с измененными РНК-связывающими свойствами. 104
Выводы 108
