Введение
1.Введение 7
2. Глюканазы и их роль в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей.
1. Введение 10
2. Молекулярная организация клеточной стенки дрожжей 11
2.1. Глюкан 11
2.2. Хитин 14
2.3. Маннопротеины 17
2.3.1. N-маннозилирование 17
2.3.2. О-маннозилирование 19
2.3.3. Белки, содержащие гликозил-фосфоинозитольный якорь 20
2.4. Связь макромолекул в составе клеточной стенки дрожжей 23
2.4.1. Ковалентные связи между полисахаридными компонентами в составе клеточной стенки дрожжей 23
2.4.2. Типы встраивания белков в клеточную стенку дрожжей 23
2.4.3. Модульная организация клеточной стенки дрожжей 25
3. Известные глюканазы дрожжей: основные характеристики 28
3.1. Семейство GH5 28
3.2. Семейство GH81 30
3.3. Семейство GH16 31
3.4. Семейство GH72 32
3.5. Семейство GH17 34
4. Регуляция экспрессии генов, кодирующих ферменты, обладающие глюканазной активностью 36
4.1. Зависимая от клеточного цикла регуляция экспрессии генов «глюканаз» 36
4.2. Стресс индуцируемая регуляция экспрессии генов 38
5. Функции «ГЛЮКАНАЗ» 41
6. Заключение и постановка задач исследования 44
3. Материалы и методы 46
1. Используемые в работе реактивы 46
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 46
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов 47
3.1. Среды для выращивания Е. coli 47
3.2. Среды для выращивания дрожжей 47
4. Использованные в работе плазмиды 48
5. Определение чувствительности дрожжей к присутствию в среде культивирования Конго красного и додецилсульфату натрия 48
6. Трансформация клеток Е. coli 48
7. Трансформация клеток дрожжей 49
8. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 49
9. Выделение суммарной ДНК дрожжей 50
10. Электрофоретические методы 50
10.1. Электрофорез в агарозном геле 50
10.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 51
11. Вестерн-блот анализ 51
12. Окраска белков при помощи Кумасси 52
13. Окраска белков при помощи нитрата серебра 52
14. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения 53
15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
16. Выделение клеточных стенок дрожжей 54
17. Обработка клеточных стенок протеиназой К 55
18. Экстракция белков из предварительно биотинилированных клеточных стенок дрожжей (Mrsa et al., 1997) 55
19. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 56
20. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков 56
21.Фракционирование клеток для получения препаратов белков изолированной плазматической мембраны и внутриклеточного содержимого 57
22. Измерение суммарного белка в препарате 57
22.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду (Bradford, 1976) 57
22.2 Определение концентрации белка по Лоури (Lowry et al., 1951) 57
23. Измерение суммарного клеточного белка (микробиуретовый метод) 58
24. Анализ карбоксипептидазы Y (СРY) 58
25. Анализ глюкозоксидазы, секретируемой клетками Н. polymorpha 58
26. Электронно-микроскопические методы 59
26.1 Электронная микроскопия клеток дрожжей 59
26.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Bgl2p 59
27. Спектроскопия кругового дихроизма 60
28. Изучение связывания красителя Конго красного (КК) 60
29. Изучение связывания флуоресцентного красителя Thioflavine Т (ThT) 60
30. Прочие методы 60
30.1 В ходе работы применяли стандартные методики частной генетики дрожжей 60
30.2 Определение количества полисахаридных компонентов в изолированных КС дрожжей 61
4. Результаты и обсуждение 62
1. Получение изогенных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae с делениями генов BGL2 и GAS1, а так же с одновременным нарушением обоих указанных генов 62
2. Сравнительный фенотипический анализ полученных штаммов Saccharomyces cerevisiae с нарушенными генами BGL2 и GAS1 64
3. Получение и характеристика штамма дрожжей Hansenula polymorpha, лишенного гена BGL2 68
4. Получение штамма дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенной глюкантрансферазой Gas 1 р 71
4.1. Анализ белков клеточной стенки Ауріб мутанта 76
4.2. Анализ белков цитоплазматической мембраны Аур(6 мутанта 76
4.3. Анализ вакуолярного белка карбоксипептидазы Y (CPY) 77
4.4. Анализ секретируемого белка глюкозооксидазы (ГО) 79
4.5. Фенотипический анализ штамма Aypt6 дрожжей Н. polymorpha 80
5. Выявление нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей S. cerevisiae в отсутствии глюкантрансфераз Bgl2p и Gaslp 82
6. Изучение конформационных особенностей глюкантрансферазы Bgl2p дрожжей S. cerevisiae 83
6.1. Подбор условий для экстракции Bgl2p из клеточной стенки в нативной конформации 86
6.1.1. Экстракция Bgl2p с помощью глюканазы 86
6.1.2. Экстракция Bgl2p с помощью мягких термических обработок 91
6.2. Физико-химические характеристики фибрилл, образованных in vitro глюкантрансферазой Bgl2p 95
6.2.1. Определние вторичной структуры глюкантрансферазы Bgl2p 96
6.2.2. Связывание Конго Красного 97
7. Изучение физиологической роли белка Bgl2p дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способного формировать амилоидные фибриллы 100
Выводы 106
