Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы исследования соматических мутаций генов kras и braf в опухолях 16
1.1 Соматические мутации и канцерогенез 16
1.2 KRAS и BRAF – участники Ras-Raf-MEK-ERK сигнального пути 17
1.3 Мутации в генах KRAS и BRAF и таргетная терапия при РТПК 20
1.4 Мутации в гене BRAF и таргетная терапия меланомы кожи 22
1.5 Мутации в генах KRAS и BRAF при раке легкого 25
1.6 Мутации в генах KRAS и BRAF при карциноиде ЖКТ 27
1.7 Проблема выделения ДНК из ФФЗП опухолевого материала 28
1.8 Проблема выбора метода диагностики соматических мутаций в опухолях 29
1.9 Классификация ПЦР методов диагностики соматических мутаций 33
1.10 NGS как метод диагностики соматических мутаций в опухолях 39
1.11 Заключение о проблеме анализа соматических мутаций в генах KRAS и BRAF в опухолях 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1 Образцы опухолей 42
2.2 Выделение ДНК
2.2.1 Лизис ФФЗП ткани 43
2.2.2 Депарафинизация лизата ФФЗП образцов хлороформом 43
2.2.3 Депарафинизация лизата ФФЗП образцов вымораживанием 44
2.2.4 Методы очистки ДНК из лизата опухолевой ткани 44
2.2.5 Эталонный метод выделения ДНК из ФФЗП ткани 44
2.3 ДНК стандарты с мутациями. 45
2.4 Методы анализа мутаций 45
2.4.1 АС-ПЦР в режиме реального времени с аллель-специфическими праймерами. 45
2.4.2 АС-ПЦР с LNA-блокером для анализа мутаций KRAS 46
2.4.3 Методика анализа результатов АС-ПЦР 47
2.4.4 Пиросеквенирование 47
2.4.5 Секвенирование KRAS с использованием LNA-блокера для обогащения мутантным аллелем 48
2.4.6 Секвенирование генов KRAS и BRAF по Сэнгеру как «золотой стандарт» диагностики мутаций 48
ГЛАВА 3. Результаты исследования 50
3.1 Оптимизация методики выделения ДНК из ФФЗП опухолевого материала 50
3.1.1 Определение потерь ДНК при разных методах очистки 51
3.1.2 Сравнение методов выделения ДНК на образцах ФФЗП ткани 53
3.1.3 Сравнение методов депарафинизации ФФЗП материала 54
3.1.4 Валидация разработанного протокола выделения ДНК из ФФЗП
материала 55
3.2 Разработка методики анализа мутаций в 600 кодоне гена BRAF 58
3.2.1 Разработка АС-ПЦР 58
3.2.2 Аналитическая чувствительность АС-ПЦР 61
3.2.3 Аналитическая чувствительность пиросеквенирования 63
3.2.4 Валидация методики АС-ПЦР 64
3.3 Разработка методики анализа мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS 68
3.3.1 АС-ПЦР 68
3.3.2 Аналитическая чувствительность АС-ПЦР KRAS 70
3.3.3 Секвенирование по Сэнгеру с использованием LNA-блокера 71
3.3.4 Аналитическая чувствительность пиросеквенирования 73
3.3.5 Валидация АС-ПЦР 74
3.4 Определение относительного содержания опухолевых клеток в образцах от российских пациентов 75
3.5 Определение частот соматических мутаций KRAS и BRAF в опухолях у российских пациентов 77
3.5.1 Частота мутаций BRAF V600 у пациентов с меланомой кожи 77
3.5.2 Частота мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS и BRAF V600 у
пациентов при НМРЛ и карциноиде 77
3.5.3 Частота мутаций в генах KRAS и BRAF при РТПК 77
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 79
4.1 Метод выделения ДНК из ФФЗП материала 79
4.2 Методы анализа мутаций в генах KRAS и BRAF
4.2.1 АС-ПЦР для анализа мутаций в гене BRAF 82
4.2.2 Пиросеквенирование для анализа мутаций BRAF V600 84
4.2.3 АС-ПЦР для анализа мутаций в гене KRAS 85
4.2.4 Секвенирование по Сэнгеру для анализа мутаций в гене KRAS 88
4.2.5 Пиросеквенирование для анализа мутаций в гене KRAS 90
4.3 Частоты мутаций KRAS и BRAF в опухолях у российских пациентов 91
4.3.1 Выбор метода анализа мутаций 91
4.3.2 Мутации в гене BRAF при меланоме кожи у российских пациентов 91
4.3.3 Мутации в генах KRAS и BRAF при РТПК 93
4.3.4 Мутации в генах KRAS и BRAF при НМРЛ и карциноиде ЖКТ. 94
Заключение 96
Выводы 101
Перспективы дальнейшей разработки темы 102
Список сокращений 104
Список литературы 105
