Введение
Глава 1. Обзор литературы .22
1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила 22
1.1.1. Экология вируса Западного Нила 22
1.1.2. Эпидемиология вируса Западного Нила 22
1.1.3. Географическое распространение вируса Западного Нила 28
1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция 30
1.2.1. Происхождение и эволюция вируса Западного Нила 30
1.2.2. Молекулярная эволюция ВЗН 34
1.2.3. Генотипы вируса Западного Нила 43
1.3. Генетическая организация и репликативный цикл флавивирусов .44
1.3.1. Общее строение вирусного генома 44
1.3.2. Трансляция вирусного генома 47
1.3.3. Процессинг и биологические функции неструктурных белков 48
1.3.4. Репликация вирусного генома 50
1.3.5. Образование зрелых структурных белков и сборка вириона
1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН 53
1.5. Разработка вакцин к вирусу Западного Нила
1.5.1. Требования к вакцине против вируса ЗН 59
1.5.2. Ветеринарные вакцины против вируса Западного Нила .61
1.5.3. Вакцины против вируса Западного Нила для человека 62
1.5.4. Вакцины, проходящие клинические испытания .62
1.5.5. Вакцины, на стадии доклинической разработки
1.5.5.1. Субъединичные вакцины 64
1.5.5.2. ДНК-вакцины 66
1.5.5.3. Нерепликативные вакцины одного цикла .67
1.5.5.4. Инактивированные вирусные вакцины .67
1.5.5.5. Рекомбинантные вакцины на основе вирусных векторов...69
1.5.5.6. Химерные вакцины .69
1.5.5.7. Живые аттеньюированные вакцины, полученные из инфекционных клонов .70
1.5.5.8. Кандидаты в вакцины против ВЗН на базе рекомбинантной вакцины против кори 72
1.5.5.9. Вакцина MVSchw-sEwnv 73
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы 75
2.1. Места сбора и объем полевого материала .75
2.2. Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов 79
2.3. Вирусологическое обследование 79
2.4. Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе .80
2.5. Компьютерный анализ последовательностей ДНК 87
2.6. Выделение РНК .87
2.7. Реакция обратной транскрипции .88
2.8. Проведение полимеразной цепной реакции 88
2.9. Клонирование кДНК-фрагментов генома 89
2.10. Приготовление компетентных клеток .89
2.11. Трансформация плазмидной ДНК 89
2.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле 90
2.13. Выделение фрагментов ДНК из агарозы 90
2.14. Секвенирование ДНК 91
2.15. Сайт-направленный мутагенез ДНК 91
Глава 3. Результаты 93
3.1. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных до 2001 г 93
3.1.1. Стратегия подбора первой пары праймеров для проведения ПЦР 94
3.1.2. Определение и анализ первичной структуры части генома штаммов ВЗН от 5 -конца до праймера 3594Runi 97
3.1.3. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипа 1 101
3.1.4. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипов 2,4 и 5 .106
3.1.5. Определение и анализ 5 -концевых последовательностей геномов штаммов ВЗН
3.2. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г 107
3.3. ОТ-ПЦР тест система для обнаружения РНК вируса ЗН 1 3.3.1. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса ЗН в клинических образцах и пробах полевого материала .108
3.3.2. Разработка параметров проведения ПЦР для первого и второго раундов амплификации 113
3.3.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест системы 117
3.3.4. Проверка работы ОТ-ПЦР тест-системы на различных генотипах вируса ЗН 121
3.4. Исследование полевого материала 122
3.4.1. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы 122
3.4.2. Анализ зараженности видового состава комаров .124
3.4.3. Анализ положительных проб для определения генотипа вируса при помощи определения частичной нуклеотидной последовательности .128 3.4.4. Статистическая обработка результатов .129 3.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила 131
3.5.1. Получение плазмид, несущих кДНК-фрагменты вирусной РНК 131
3.5.2. Транскрипция РНК in vitro 132
Глава 4. Обсуждение результатов 134
4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН 134
4.1.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа 134
4.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г 139
4.1.3. Анализ штамма 322 2-го генотипа 143
4.1.4. Анализ штамма Ksnd190 4-го генотипа 148
4.1.5. Анализ штамма Ig2266 5-го генотипа 1 4.2. Анализ генетических детерминант патогенности ВЗН .152
4.3. ОТ-ПЦР тест-система для обнаружения РНК ВЗН 155
4.4. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие ВЗН при помощи ОТ-ПЦР системы .156
4.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила 157
4.6. Значимость полученных данных о нуклеотидных последовательностях ВЗН, заложенных в базу данных .158 ВЫВОДЫ 161
Благодарности 163
Список цитируемой литературы
