Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность темы исследования 6
1.2. Степень разработанности темы исследования 7
1.3. Цель и задачи исследования 8
1.4. Научная новизна 8
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы 9
1.6. Методология и методы исследования 9
1.7. Положения, выносимые на защиту 9
1.8. Степень достоверности и апробация результатов 10
2. Обзор литературы 12
2.1. Структурно-функциональная организация мрнк и механизмы регуляции экспрессии генов эукариот 12
2.1.1. Использование альтернативных промоторов 12
2.1.2. Роль 5 -НТО в регуляции трансляции
2.1.2.1. Вторичная структура 5 -НТО 75
2.1.2.2. IRES элементы 16
2.1.2.3. AUG кодоны в 5 -НТО (upstream AUG, uAUG) 18
2.1.2.4. uORFs (короткие открытые рамки считывания в 5 -НТО) 18
2.1.2.5. Терминальные олигопиримидиновые тракты 20
2.1.2.6. Взаимодействия РНК-белок 21
2.1.3. Альтернативный сплайсинг 22
2.1.4. Альтернативное полиаденилирование (АПА) 26
2.1.5. Роль 3 -НТО транскриптов в регуляции экспрессии генов
2.1.5.1. Цис-действующие регуляторные элементы в мРНК. 29
2.1.5.2. Контроль трансляции с использованием длины поли(А) последовательности 31
2.1.5.3 Роль З -НТО в локализации транскриптов 32
2.1.6. Нонсенс-опосредованная деградация мРНК
2.2. Ген SGMS1 человека 40
2.2.1. Структурная организация гена SGMS1 40
2.2.2. Белок SMS1 и катализируемая им реакция 43
2.2.3. Функции SMS1 в клетке 45
2.2.4. Влияние нарушения функционирования SMS1 на развитие болезней 51
3. Материалы и методы 56
3.1. Биоинформатические методы анализа 56
3.1.1. Конструирование гипотетических альтернативных транскриптов 56
3.1.2. Поиск и анализ гипотетических промоторных областей 56
3.1.3. Анализ структуры транскриптов 57
3.1.4. Поиск открытых рамок считывания и анализ гипотетических белковых продуктов 57
3.2. Выделение тотальной рнк из тканей человека 57
3.2.1. Выделение тотальной РНК 57
3.2.2. Обработка препаратов РНК ДНКазой I 3.2.3 Измерение концентрации РНК 59
3.2.4 Электрофоретическое разделение тотальной РНК 59
3.3 ОТ-ПЦР 60
3.3.1 Синтез одноцепочеченой кДНК 60
3.3.2 Полимеразная цепная реакция 60
3.3.3 Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в ПААГ 61
3.3.4 Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле 64
3.3.5 Оценка относительного содержания транскриптов с использованием ОТ-ПЦР 64
3.3.6 Обработка ДНК фага рестрицирующей эндонуклеазой Pst I 65
3.4. Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР 65
3.4.1 Элюция продуктов ОТ-ПЦР из агарозного геля 65
3.4.2 Автоматическое секвенирование
3.5 Амплификация концов КДНК 66
3.6 ПЦР в реальном времени
3.6.1 Полимеразная цепная реакция 68
3.6.2 Статистический анализ данных ПЦР в реальном времени 68
3.7. Клонирование последовательностей КДНК 70
3.7.1 Получение компетентных клеток 70
3.7.2 Клонирование последовательностей кДНК в вектор pUC19 71
3.7.3 Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC19 с участками кДНК, соответствующей ОРС транскриптов гена SGMS1 71
3.7.4 Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pUC 19 73
3.7.5 Конструирование рекомбинантной плазмиды pEGFP-С2 с участками кДНК, соответствующей ОРС транскриптов гена SGMS1 73
3.7.6 Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pEGFP-C2 75
3.8. Трансфекция и электропорация клеток hela и vero 76
3.8.1 Культивирование клеток 76
3.8.2 Липосомная трансфекция клеток HeLa и Vero 76
3.8.3 Электропорация клеток HeLa 76
3.9. Электрофорез белков в ПААГ 77
3.10. Вестерн-блоттинг и иммунофлуоресцентное окрашивание белков 78
3.11. Фиксация клеток vero на стеклах и иммунофлуоресцентное окрашивание белков 79
3.12. Микроскопия 80
3.13. Выделение РНК из клеток HeLa, ОТ-ПЦР 80
4. Результаты 81
4.1. In silico конструирование гипотетических альтернативных транскриптов гена sgms1 и определение их экзонной структуры 81
4.2. Выявление предсказанных транскриптов в тканях человека и установление их первичной структуры
4.3. Определение первичной структуры 5 - и з -концов альтернативных транскриптов 92
4.4. Особенности структурной организации 5 - и 3 - нто альтернативных транскриптов гена SGMS1 93
4.4.1. 5 - НТО альтернативных транскриптов 93
4.4.2. 3 - НТО транскриптов альтернативных транскриптов 94
4.5. Анализ гипотетических белковых продуктов, кодируемых альтернативными транскриптами 96
4.6. Определение внутриклеточной локализации белков, кодируемых транскриптами гена sgms1 98
4.7. Поиски и характеристика гипотетических промоторных областей гена sgms1 101
4.8. Особенности экспрессии гена sgms1 в разных тканях человека 103
4.9. Анализ экспрессии гена sgms1 в опухолях легкого и пищевода 1 4.9.1. Экспрессия гена SGMS1 в нормальных тканях легкого и пищевода 108
4.9.2. Снижение экспрессии гена SGMS1 в опухоли легкого 108
4.9.3. Разнонаправленное изменение содержания транскриптов гена SGMS1 в опухоли пищевода ПО
5. Обсуждение результатов 112
6. Заключение 127
7. Выводы 129
8. Список основных сокращений 130
9. Список литературы
