Введение
Общая характеристика работы 7
Актуальность темы исследования 7
Цели и задачи исследования 8
Научная новизна и практическая значимость работы 9
Положения, выносимые на защиту 10
Степень достоверности и апробация результатов 10
Личное участие автора в проведении исследований 11
Обзор литературы 12
Бактериоцины 12
Микроцины 13
Микроцины класса 1 16
Микроцин B17 16
Микроцин J25 17
Микроцин С7-C51 19
Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик 21
История открытия микроцинов 21
Расшифровка структуры микроцина 22
Гены синтеза микроцина С 23
Роль белков микроцинового кластера 27
Возможные гомологи генов микроцинового кластера 28
Регуляция генов микроцинового кластера 30
Механизм действия микроцина С 33
Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов 34
Белок MccB 39
Ферментативная функция белка МссВ 39
Структура белка МссВ 42
Положение пептидного субстрата в активном центре пептид-связывающего домена 45
Структура аденилирующего активного центра 46
Уникальные черты активного центра белка МссВ 48
Конформационная подвижность активных центров 48
E1-суперсемейство 51
Филогенетическиое древо белков Е1-суперсемейства 51
Характерные структурные элементы белков Е1-суперсемейства 53
Структурные особенности белков Е1-суперсемейства 54
Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков E1 суперсемейства 58
Биологическая роль белков ThiF и MoeB 58
Сравнительный структурно-функциональный анализ белков Е1-суперсемейства MccB,
MoeB, ThiF 62
Материалы и методы 70
Бактериальные штаммы 70
Геномная и плазмидная ДНК 70
Питательные среды 70
Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам 71
Метод ПЦР 71
Праймеры для ПЦР 72
Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера 73
Электрофорез в агарозном геле 73
Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля 73
Расщепление ДНК рестриктазами 74
Лигирование фрагментов ДНК 74
Клонирование фрагментов ДНК 74
Мутагенез по методу Даценко-Уорнера 76
Приготовление химически компетентных клеток E. coli 76
Трансформация компетентных клеток E. coli 77
Пептиды 77
Получение и очистка рекомбинантных белков 78
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 80
Аденилирование пептидов in vitro 81
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS) 81
Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам 81
Приготовление S30 клеточных экстрактов 82
Реакция аминоацилирования тРНК 82
Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах 83
Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii in vitro 83
Введение радиоактивной метки in vitro 83
Проверка токсичности аденилированного белка in vivo 84
Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ 84
Биоинформатический анализ белковых последовательностей 85
Результаты работы 87
Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli 87
Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона 87
Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro 89
Биологическая активность аденилированных пептидов 95
Активность аденилированных пептидов in vitro 98
Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений 101
Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз 103
Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ 106
Часть 2. STRONG Получение новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной
пептидной частью с помощью белка МссВ E. coli STRONG 111
Поиск нового субстрата для белка MccB E. coli путем трехмерного моделирования 111
Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro 116
Биологическая активность аденилированных пептидов 120
Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С 122
In vitro аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN 124
In vivo аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN 126
Обсуждение полученных результатов 129
Выводы 145
Список используемой литературы 146
