Введение
1. Введение 7
2. Цели и задачи исследования 9
3. Положения, выдвигаемые для защиты 10
4. Обзор литературы 11
4.1. Ген и белок Pdcd4 11
4.1.1. Ген и транскрипт Pdcd4 11
4.1.2. Структура белка Pdcd4 12
4.1.3. Молекулярные механизмы действия Pdcd4 15
4.2. Регуляция активности Pdcd4 20
4.2.1. Регуляция транскрипции Pdcd4 20
4.2.2. Регуляция трансляции Pdcd4 21
4.2.3. Регуляция стабильности белка Pdcd4 23
4.2.4. Внутриклеточная локализация Pdcd4 26
4.2.5. Регуляция активности Pdcd
4 4.3. Характер экспрессии Pdcd 4 30
4.4. Функции Pdcd4
4.4.1. Pdcd4, апоптоз и контроль пролиферации клеток 32
4.4.2. Влияние Pdcd4 на клеточный цикл 35
4.5. Pdcd4 и неопластическая трансформация 36
4.5.1. Pdcd4 и онкогенез: причинно следственная связь 36
4.5.2. Прогностическое значение Pdcd4 39
4.5.3. Pdcd4 и супрессия роста опухолевых клеток 40
4.5.4. Ангиогенез 41
4.5.5. Pdcd4 и прогрессия опухоли 42
4.5.6. Pdcd4 и хеморезистенция 45
4.5.7. Pdcd4 как интегральный маркер про-онкогенных изменений 47
4.6. Заключение 48
5. Материалы и методы 50
5.1. Реактивы 50
5.2. Культуры клеток, реагенты и трансфекция 50
5.3. Вестерн-блот анализ и антитела 51
5.4. Выделение РНК и ПНР в реальном времени
5.5. Ферменты 55
5.5.1. Гидролиз ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции 55
5.5.2. Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова 55
5.5.3. Лигирование фрагментов ДНК 55
5.6. Получение плазмидных конструкций 55
5.6.1. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики 55
5.6.2. Приготовление компетентных клеток Е. coli 56
5.6.3. Трансформация клеток Е. coli 56
5.6.4. Секвенирование ДНК 56
5.6.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 57
5.6.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 57
5.6.7. Очистка фрагментов ДНК 57
5.6.8. Полимеразная цепная реакция 57
5.6.9. Клонирование продуктов ПЦР 57
5.6.10. Получение плазмидных конструкций
5.7. Двойной люциферазный анализ 61
5.8. Статистическая обработка результатов 61
6. Результаты и обсуждение 63
6.1. Анализ экспрессии Pdcd4 в клетках меланомы человека 63
6.1.1. Уровень белка Pdcd4 в клетках меланомы и нормальных меланоцитах 63
6.1.2. Роль Akt и MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках меланомы 6.2. Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака легких 71
6.3. Роль Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках рака легких 73
6.4. Роль протеинкиназы GSK3P в регуляции экспрессии супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках линии рака легких 75
6.5. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в клетках опухолей легких 77
6.6. Влияние ингибиторов Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути рапамицина и LY29002 на уровень транскрипта Pdcd4 78
6.7. Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких 79
6.8. mTOR-зависимая супрессия активности промотора гена Pdcd4 в клетках линии рака легких 84 6.8.1. Способность ингибитора mTOR рапамицина оказывать действие на активность промоторной области гена Pdcd4 85
6.8.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, ответственного за влияние Akt-сигнального пути на транскрипционную активность промотора гена Pdcd4 86
6.8.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных факторов с делеционным мутантом промотора гена Pdcd4 87
6.8.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного мутанта минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, опосредующего эффект рапамицина
7. Заключение 92
6. Выводы 93
Личный вклад автора 94
Благодарности 95
Список литературы
