Введение
Инициация трансляции у архей 7
1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей
2. Архейные факторы инициации трансляции
2.1. aIF1 15
2.2. aIF1A 18
2.3. aIF2 22
2.4. aIF5B 38
2.5. aIF6 46
Заключение 51
Материалы и методы 52
1. Материалы и приборы 52
1.1. Химические реактивы и ферменты 52
1.2. Буферы и среды 53
1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды 53
1.4. Принадлежности 54
1.5. Приборы 54
2. Методы генной инженерии и микробиологии 55
2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF2 55
2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК 57
2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы 58
2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции 58
2.5. Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция 58
2.6. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового шока 59
2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках E. coli 59
3. Биохимические методы при работе с белками 60
3.1. Препаративное выделение и очистка -субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 60
3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2, aIF2D3, aIF2D23, aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 62
3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 62
3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2 и eIF2 S. cerevisiae из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 63
3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF2 64 3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков 65
3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 65
3.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде 66
3.9. Кристаллизация aIF2 и ее мутантных форм в свободной и нуклеотид-связанных формах 66
4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами 67
4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК 67
4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента 69
4.3. Аминоацилирование тРНК 70
4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях 71
4.5. Препаративная очистка нуклеотидов 71
4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов 71
4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов 72
5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами 72
5.1. Получение мРНК-белковых комплексов 72
5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ 72
5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы 73
5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса 73
5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов
aIF2GDPNPMet-тРНКf и e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 75
5.6. Кристаллизация тройственных комплексов aIF2GDPNPMet-тРНКf и e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 76
Результаты и обсуждение 77
1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf 77
2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae 87
3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 90
4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2 S. solfataricus 92
5. «Рабочий» цикл aIF2 S. solfataricus 108
Выводы 117
Список литературы 118
