Введение
Глава 1. Обзор литературы флуоресцентные ДНК-зонды 7
1.1. Основные принципы дизайна олигонуклеотидных зондов 7
1.1.1. Неприродные модификации основной цепи зонда 9
1.1.2. Ненуклеозидные суррогаты для модификации олигонуклеотидной цепи 10
1.1.3. Флуоресцентные маркеры 12
1.1.4. FRET (Frster resonance energy transfer) в олигонуклеотидных зондах 15
1.1.5. Тушители флуоресценции 17
1.1.6. Эксимерные и эксиплексные системы 20
1.2. Зонды для флуоресцентной гибридизации in situ (fish) 22
1.2.1. Полинуклеотидные зонды 22
1.2.2. Олигонуклеотидные зонды 23
1.2.3. Непрямые способы мечения 23
1.2.4. Card-fish 24
1.2.5. Rca-fish 25
1.2.6. bDNA-fish и fish-STICs 25
1.2.7. HCR-fish 28
1.3. Классификация флуоресцентных олигонуклеотидных зондов 30
1.3.1. Молекулярные маяки 30
1.3.1.1. Классические молекулярные маяки 30
1.3.1.2. Молекулярные маяки с несколькими флуорофорами и тушителями 31
1.3.1.3. Молекулярные маяки с переносом энергии 35
1.3.1.4. Эксимерные молекулярные маяки 37
1.3.1.5. Конъюгаты молекулярных маяков с проникающими пептидами 41
1.3.2. Смежные зонды 42
1.3.2.1. Смежные зонды с переносом энергии 42
1.3.2.2. Смежные зонды с тремя флуорофорами 43
1.3.2.3. Эксимерные смежные зонды 43
1.3.2.4. Смежные зонды со структурой молекулярных маяков 44
1.3.2.5. Смежные зонды для времяразрешенной детекции люминесцентного сигнала 45
1.3.2.6. Зонды с матричным лигированием 49
1.3.2.7. Матричная активация флуорофора в составе смежных зондов 53
1.3.3. TaqMan зонды 58
1.3.4. Прочие зонды для кПЦР 60
1.3.4.1. Шпилечные зонды-праймеры 60
1.3.4.2. Цикликоны 61
1.3.4.3. AnglerTM 61
1.3.4.4. ResonSenseTM 61
1.3.4.5. HyBeaconTM 61
1.3.5. Инь-Янь зонды 62
1.3.6. Зонды с интеркалирующими красителями (без тушителя) 63
1.3.6.1. Последовательность-чувствительные зонды на основе ПАУ 63
1.3.6.2. Зонды с тиазоловым оранжевым 67
Глава 2. Обсуждение результатов мономеры на основе D-(-)-пантолактона и азидопроизводные для мечения олигонуклеотидов 69
2.1 Эксимерные молекулярные маяки 69
2.1.1 Синтез мономеров на основе D-(-)-пантолактона для мечения молекулярных маяков. 70
2.1.2. Синтез молекулярных маяков, меченных пиреновыми флуорофорами и тушителем Dabcyl 73
2.1.3. Изучение фотофизических свойств полученных зондов. 75
2.1.4. Молекулярное моделирование стабильности эксимерных флуорофоров 77
2.1.5. Пиреновый эксимер в качестве FRET-донора в олигонуклеотидных зондах. 79
2.1.6. Изучение резонансного переноса между эксимером и сульфо-Су3 при со-расположении на олигонуклеотидной матрице. Оптимизация структуры зондов . 81
2.1.7. Определение эффективности FRET от пиренового эксимера к сульфо-Су3 89
2.2. Синтез азидопроизводных красителей и их применение для флуоресцентных ДНК-зондов 93
2.2.1. Библиотека функциональных азидопроизводных для твердофазного мечения олигонуклеотидов 93
2.2.2. Применение функциональных азидопроизводных для твердофазной модификации олигонуклеотидов 96
2.2.3. PEPy – новый маркер для кПЦР 99
2.2.3.1. Модификация олигонуклеотидных зондов. 99
2.2.3.2. Изучение флуоресценции РЕРу в олигонуклеотидных зондах 99
2.2.3.3. Сравнение РЕРу с аминокумаринами в качестве флуоресцентных меток зондов для кПЦР 103
2.3. Конъюгация иммуноглобулинов с олигонуклеотидами 106
2.3.1. Синтез реагентов для конъюгации иммуноглобулинов с олигонуклеотидами. 107
2.3.2. Мечение моноклонального антитела кросс-сшивающим реагентом на основе сульфо-Су5 110
2.3.3. Конъюгация меченых антител с олигонгуклеотидами 113
Глава 3. Экспериментальная часть 118
Выводы 151
Благодарности 152
Список сокращений 153
Список используемой литературы 155
Приложения 177
