ОГЛАВЛЕНИЕ ................................................................................................................ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................. 5
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 15
1.1 Характеристика рода Rhizochromulina Hibberd & Chrétiennot-Dinet 1979 ... 15
1.2 Общая характеристика класса Dictyochophyceae .......................................... 17
1.3 Филогенетическое положение класса Dictyochophyceae ............................... 18
1.4 Редукция жгутиковых аппаратов Dictyochophyceae как часть эволюционного тренда в группе Diatomista .......................................................... 20
1.5 Амебоидная подвижность микроорганизмов с тубулиновым цитоскелетом псевдоподий .............................................................................................................. 25
1.6 Разнообразие амебофлагеллят и амебоидно-жгутиковый переход .............. 28
1.6.1 Амебоидно-жгутиковый переход у Naegleria ......................................... 29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ .......................................................................... 32
2.1. Выделение нового штамма Rhizochromulina из естественного местообитания и условия культивирования .......................................................... 32
2.2 Запуск перехода из амебоидной формы в жгутиковую ................................. 33
2.3 Светооптическая микроскопия ......................................................................... 33
2.4 Иммунофлюоресцентное окрашивание тубулина .......................................... 34
2.5 Окрашивание актина флуоресцентно-меченым фаллоидином ..................... 35
2.6 Визуализация флуоресценции, обработка изображений ............................... 36
2.7 Просвечивающая электронная микроскопия .................................................. 36
2.8 Реконструкция филогении порядка Rhizochromulinales ................................ 37
2.8.1 Выделение ДНК из клеток Rhizochromulina cf. marina В44 .................. 37
2.8.2 Амплификация и секвенирование фрагментов генов 18S рРНК, psaA и rbcL Rhizochromulina cf. marina В44 ................................................................. 37
2.8.3 Филогенетический анализ ......................................................................... 39
2.9 Поиск характерных для Rhizochromulina cf. marina В44 мутаций гена 18S рРНК .......................................................................................................................... 41
2.10 Исследование подвижности амебоидных клеток Rhizochromulina cf. marina B44 ............................................................................................................................. 41
2.10.1 Подготовка культур ................................................................................. 41
2.10.2 Дизайн экспериментов ............................................................................ 42
2.10.3 Запись и обработка видео........................................................................ 43
2.10.4 Отслеживание подвижности клеток ...................................................... 44
2.10.5 Статистическая обработка данных ........................................................ 45
2.10.6 Флуоресцентное окрашивание клеток ................................................... 47
2.11 Сравнительный анализ профилей экспрессии генов амебоидных и жгутиковых клеток Rhizochromulina cf. marina B44 ............................................ 47
2.11.1 Культивирование и фиксация клеток .................................................... 47
2.11.2 Выделение тотальной РНК ..................................................................... 49
2.11.3 Создание библиотек РНК и секвенирование ........................................ 49
2.11.4 Биоинформатическая обработка и анализ данных ............................... 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ............................................................................................. 52
3.1 Общая морфология клеток Rhizochromulina cf. marina В44 .......................... 52
3.2 Ультраструктура клеток Rhizochromulina cf. marina В44 .............................. 54
3.3 Филогенетическое положение Rhizochromulina cf. marina В44 .................... 57
3.3.1 Эволюционные отношения представителей порядка Rhizochromulinales .............................................................................................. 57
3.3.1 Анализ выравнивания последовательностей гена 18S рРНК представителей порядка Rhizochromulinales .................................................... 59
3.4 Организация цитоскелета Rhizochromulina cf. marina В44 и особенности подвижности амебоидных клеток .......................................................................... 60
3.4.1 Организация тубулинового и актинового цитоскелета в нативном состоянии ............................................................................................................. 60
3.4.2 Влияние латрункулина B и нокодазола на подвижность, морфологию и организацию цитоскелета амебоидных клеток ................................................ 63
3.4.2.1 Статистическая модель подвижности амебоидных клеток ........... 63
3.4.2.2 Изменения морфологии амебоидных клеток и пространственной
организации их цитоскелета ......................................................................... 67
3.5 Исследование амебоидно-жгутикового перехода у Rhizochromulina cf. marina В44 ............................................................................... 71
3.5.1 Исследование перехода на светооптическом уровне ............................. 71
3.5.2 Сравнение профиля экспрессии генов амебоидных и жгутиковых клеток ................................................................................................................... 72
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................................... 80
4.1 Морфология и ультраструктура клеток Rhizochromulina cf. marina В44 ..... 80
4.1.1 Мероплазмодии .......................................................................................... 80
4.1.2 Строение хлоропласта ............................................................................... 81
4.1.3 Особенности организации тубулинового и актинового цитоскелета .. 81
4.1.4 Строение жгутикового аппарата .............................................................. 82
4.2 Таксономический статус штамма В44 и рода Rhizochromulina .................... 83
4.3 Экология и местообитание Rhizochromulina cf. marina В44.......................... 87
4.4 Подвижность амебоидных клеток Rhizochromulina cf. marina В44 .............. 88
4.4.1 Влияние нокодазола и латрункулина B на подвижность амебоидных клеток ................................................................................................................... 88
4.4.2 Влияние плотности популяции на подвижность амебоидных клеток . 90
4.5 Амебоидно-жгутиковый переход у Rhizochromulina cf. marina В44 ............ 92
4.5.1 Адаптационная роль амебоидно-жгутикового перехода, разделение амебоидной и жгутиковой стадий жизненного цикла Rhizochromulina cf. marina В44 .......................................................................... 92
4.5.2 Различия паттернов экспрессии генов в амебоидных и жгутиковых клетках Rhizochromulina cf. marina В44 ........................................................... 96
ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 106
БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................... 128
ПРИЛОЖЕНИЕ ........................................................................................................... 129
