Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1 Воздействие ионизирующего излучения на генетический материал клетки 16
1.2 Действие импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ) на биологические объекты 20
1.3 Ионизирующее излучение и индивидуальная радиочувствительность 22
1.3.1 Биомаркеры радиационного воздействия 26
1.3.1.1 Анализ фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК 28
1.3.1.2 Микроядерный тест 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1 Материалы 45
2.2 Дизайн исследования 46
2.2.1 Схемы проведения экспериментов 50
2.2.1.1 Анализ генотоксического действия наносекундного ИПРИ на лимфоциты периферической крови человека и опухолевые клетки MOLT-4 50
2.2.1.2 Оценка цитогенетических эффектов ИПРИ в малых дозах с использованием микроядерного теста 50
2.2.1.3 Анализ влияния мощности дозы ИПРИ на биологический эффект 51
2.2.1.4 Анализ влияния окислительного стресса на эффективность репарации ДНК в лимфоцитах человека после воздействия ИПРИ 52
2.2.1.5 Анализу зависимости цитогенетических эффектов от типа излучения (наносекундное ИПРИ и непрерывное гамма-излучение) 52
2.2.1.6 Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах периферической крови человека 52
2.2.1.7 Анализ генотоксического действия гамма-излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в экспраэмбриональных фибробластах мезодерны 53
2.2.2 Облучение материала 53
2.3 Методы 54
2.3.1 Получение и культивирование материала 54
2.3.1.1 Получение и выделение лимфоцитов из периферической крови человека 54
2.3.1.2 Получение и культивирование опухолевых клеток человека MOLT-4 55
2.3.1.3 Получение и культивирование первичных экстраэмбриональных фибробластов человека 55
2.3.2 Фиксация материала 56
2.3.2.1 Фиксация лимфоцитов периферической крови человека для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX и 53ВР1) 56
2.3.2.2 Фиксация клеток опухолевой линии MOLT-4 для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX и 53ВР1) 57
2.3.2.3 Фиксация первичных экстраэмбриональных фибробластов человека для анализа фокусов белков репарации ДНК (H2AX)
2.2.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов 57
2.3.3 Получение изображений и оценка фокусов белков репарации ДНК H2AX 58
2.3.4 Приготовление препаратов двухъядерных цитокинез-блокированных соматических клеток человека для анализа микроядер 59
2.3.5 Получение центромеро-специфичных ДНК-зондов и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 59
2.3.6 Методика анализа экспрессионных профилей генов в лимфоцитах инидивидов, дифференцированных по чувствительности к действию радиации
2.3.7.1 Выделение РНК 61
2.3.7.2 Очистка РНК 61
2.3.7.3 Проверка качества РНК 62
2.3.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 63
2.3.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 63
2.3.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 64
2.3.7.7 Оценка экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени 64
2.3.8 Статистический анализ данных 65
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 67
3.1 Анализ генотоксического действия наносекундного импульсно-периодического
рентгеновского излучения в дозах до 320 мГр в соматических клетках человека 67
3.1.1 Влияние малых доз ИПРИ на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови 69
3.1.2 Влияние малых доз ИПРИ на опухолевые клетки линии MOLT-4 72
3.1.3 Оценка частоты цитогенетических повреждений в лимфоцитах периферической крови человека после воздействия ИПРИ в дозах до 100 мГр 78
3.1.4 Анализ зависимости уровня фокусов репарации ДНК в лимфоцитах человека от мощности дозы ИПРИ 81
3.1.5 Анализ зависимости гиперчувствительности к малым дозам ИПРИ от окислительно-восстановительного гомеостаза лимфоцитов периферической крови 84
3.1.6 Сравнительный анализ действия наносекундного ИПРИ и стандартного гамма-излучения 60Со на лимфоциты периферической крови человека в дозах 0,5-2,0 Гр 90
3.2 Оценка индивидуальной радиочувствительности 94
3.2.1 Влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на радиационно-индуцированный
ответ соматических клеток человека поле оюлучениея 2,0 Гр гамма-излучения 94
3.2.1.1 Оценка связи спонтанного уровня фокусов H2AX с частотой радиационно-индуцированных микроядер в лимфоцитах человека 95
3.2.1.2 Анализ зависимости цитогенетических эффектов ИИ от спонтанного уровня H2AX в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы абортусов человека 101
3.2.2 Анализ профилей экспрессии генов радиационного ответа в группах индивидов с повышенной и пониженной чувствительностью к ионизирующему излучению 105
3.2.2.1 Оценка радиационно-индуцированного уровня экспрессии генов между группами индивидов с различной радиочувствительностью 106
3.2.2.2 Оценка статистической значимости наблюдаемых различий экспрессионных профилей в исследуемых группах без поправки FDR 108
3.2.2.3 Анализ профилей экспрессии генов, представленных несколькими олигонуклеотидными пробами на микрочипе 109
3.2.2.4 Функциональная аннотация генов связанных с индивидуальной радиочувствительностью 112
3.2.2.5 Анализ профилей экспресии генов методом ПЦР в реальном времени 118
3.3 Общая характеристика генов, выявленных при анализе уровня экспрессии в
лимфоцитах «радиочувствительных» и «радиорезистентных» индивидов 120
3.3.1 Гены, ассоциированные с различной чувствительностью к действию ионизирующего излучения 120
3.3.2 Гены, кодирующие белки комплекса репарации ДНК 121
3.3.3 Гены, ассоциированные с развитием апоптоза и аутофагии 122
3.3.4 Гены, кодирующие белки клеточного ответа на повреждающее действие ДНК124
3.3.5 Гены некодирующих РНК 125
3.3.6 Гены с иными функциями, экспрессия которых значимо различалась между исследуемыми группами индивидов 126
Заключение 130
Выводы 136
Список литературы 137
