Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Цитокинез в животных клетках 11
1.1.1. Общие принципы цитокинеза 11
1.1.2. Особенности делений в генеративных клетках дрозофилы 12
1.2. Общая характеристика семейства септинов 13
1.2.1. Эволюционная консервативность септинов 14
1.2.2. Физические свойства септинов 16
1.2.3. Септиновые филаменты 19
1.2.4. Регуляция сборки септиновых филаментов 20
1.3. Молекулярные функции септинов 22
1.3.1. Септины как скаффолд 23
1.3.2. Септины как диффузные барьеры 24
1.3.3. Взаимодействие с актином и микротрубочками
1.4. Ассоциация с различными заболеваниями человека 29
1.5. Септины дрозофилы
1.5.1. Характеристика септинов дрозофилы 32
1.5.2. Септиновый комплекс дрозофилы 33
1.5.3. Роль септинов в цитокинезе дрозофилы 34
1.5.4. Роль септинов в целлюляризации 35
1.5.5. Взаимодействие септинов дрозофилы с другими белками 36
Заключение по обзору литературы 38
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними 39
2.2. Детекция -галактозидазы в различных органах дрозофилы .40
2.3. Препараты митозов нервных ганглиев 40
2.4. Получение плазмидной конструкции для проведения РНК-интерференции гена pnut 40
2.5. Получение трансгенных линий дрозофилы 41
2.6. Иммуннохимическое окрашивание органов дрозофилы з
2.6.1. Приготовление давленых препаратов семенников и нервных ганглиев личинок .41
2.6.2. Иммуннохимическое окрашивание целых органов дрозофилы .42
2.6.3. Приготовление препаратов яичников и семенников дрозофилы, окрашенных по DAPI
2.7. Определение стадии гибели эмбрионов .43
2.8. Экспрессия индивидуальных септиновых белков дрозофилы 43
2.9. ГТФазный анализ индивидуальных септинов 2.10. Очистка септинового комплекса дрозофилы из клеток, инфецированных бакуловирусом .45
2.11. Анализ связывания ГТФ рекомбинантными септиновыми комплексами 46
2.12. Анализ гидролиза ГТФ рекомбинантными септиновыми комплексами 46
2.13. Методы детекции белков 47
2.13.1. Электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии
додецилсульфата натрия по Лэммли 47
2.13.2. Окраска белкового геля с помощью Кумасси 47
2.13.3. Вестерн-блоттинг
2.14. Экспрессия рекомбинантного Orc6 .48
2.15. Электронная микроскопия
2.15.1. Электронная микроскопия септиновых комплексов и филаментов .49
2.15.2. Статистический анализ длин филаментов 49
2.15.3. Локализация Orc6 на септиновых филаментах 49
Глава 3. Результаты .51
3.1. Анализ экспрессии гена pnut 51
3.2. Влияние продукта гена pnut на деления соматических клеток 52
3.3. Изучение функций септина Pnut в гонадогенезе при помощи РНК интерференции 54
3.3.1. Получение плазмидной конструкции для проведения РНК-интерференции гена pnut 54
3.3.2. Влияние продукта гена pnut на деление генеративных клеток 56
3.3.3. Анализ нарушений сперматогенеза при эктопическом подавлении экспрессии гена pnut 58
3.3.4. Анализ нарушений оогенеза при эктопическом подавлении экспрессии гена pnut в соматических клетках яичников 60
3.4. Изучение роли функциональных доменов Pnut 63
3.4.1. Мутации гена pnut, использованные в работе 63
3.4.2. ГТФазная активность индивидуальных септинов дрозофилы 64
3.4.3. Анализ септиновых комплексов с использование мутантов Pnut по ГТФазному домену 65
3.4.4. Влияние мутаций в консервативных доменах pnut на соматические ткани дрозофилы in vivo 67
3.4.5. Влияние мутаций различных доменов Pnut на оогенез дрозофилы 75
3.4.6. Влияние мутаций различных доменов Pnut на сперматогенез дрозофилы 78
3.5. Изучение филаментообразования септиновых комплексов in vitro 79
3.5.1. Влияние ГТФ и Orc6 на формирование септиновых филаментов .79
3.5.2. Механизм Orc6-зависимого формирования септиновых филаментов 82
3.5.3. Формирование филаментов септиновыми комплексами, содержащими Pnut с мутациями в ГТФзном домене 84
Глава 4. Обсуждение 85
4.1. Роль Pnut в делении соматических и генеративных клеток 85
4.2. ГТФазная активность индивидуальных септинов 87
4.3. Формирование септинового комплекса 88
4.4. Формирование септиновых филаментов 90
4.5. Роль консервативных доменов Pnut в соматических тканях дрозофилы 92
4.6. Участие Pnut в оогенезе дрозофилы 94
4.7. Участие Pnut в сперматогенезе дрозофилы 97
Заключение .101
Выводы 103
Список литературы .
