Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1. Общее строение глаза и сетчатки позвоночных 13
1.1. Общее строение глаза позвоночных 13
1.2. Расположение, строение и функции сетчатки позвоночных 14
2. Ретинальный пигментный эпителий 15
2.1. Строение клеток ретинального пигментного эпителия 16
2.2. Гетерогенность ретинального пигментного эпителия 18
2.3. Функции ретинального пигментного эпителия 19
2.4. Развитие ретинального пигментного эпителия 2.4.1. Общие данные по нормальному развитию глаза позвоночных 21
2.4.2. Первичная индукция и специализация ретинального пигментного эпителия 23
3. Фенотипические изменения клеток ретинального пигментного эпителия позвоночных животных и человека 25
3.1. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия позвоночных животных in vivo 25
3.3.1. Регенерация ретинального пигментного эпителия млекопитающих 25
3.3.2. Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия у позвоночных
3.2. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия in vitro 29
3.3. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия человека
3.3.1. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия человека in vivo 31
3.3.2. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия человека in vitro 32
3.4. Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия взрослого человека
в нейральном направлении 35
3.4.1. Ростовые и нейротрофические факторы, стимулирующие нейроногенез 36
Нейротрофические и ростовые факторы периферической и центральной нервной системы 37
3.4.2. Использование морфогенов для стимулирования в нейральном направлении клеток
ретинального пигментного эпителия человека 40
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 42
1. Материал исследования 42
2. Методы исследования 43
2.1. Динамика поведения и фенотипические изменения клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 43
2.1.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза человека на ранних сроках развития при помощи гистологических и иммуногистохимических методов исследования 44
Гистологическое исследование 44
Иммуногистохимический анализ 44
2.1.2. Выделение клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека 45
2.1.3. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека в средах с высоким содержанием сыворотки 46
2.1.4. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития в среде с ростовыми факторами 46
2.1.5. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека ранних стадий развития, культивируемых in vitro 47
Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 47
Иммуноцитохимический анализ 47
2.2. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 47
2.2.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза взрослого человека при помощи гистологических, иммуногистохимических, методов исследования и метода полимеразной цепной реакции 48
Гистологическое исследование 48
Иммуногистохимический анализ 48
Метод полимеразной цепной реакции 49
2.2.2. Выделение клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека 49
2.2.3. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека в средах с высоким содержанием сыворотки 51
2.2.4. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека в
средах с добавление нейротрофических и ростовых факторов: основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 53
Влияние ростовых факторов основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 53
Влияние нейротрофических факторов: нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 53
2.2.5. Характеристика ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 54
Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 54
Иммуноцитохимический анализ 55
Метод полимеразной цепной реакции 55
МТТ тестирование - колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
1. Исследование изменений поведения и фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 57
1.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза человека на ранних сроках развития 57
1.1.1. Гистологическое исследование 57
Ретинальный пигментный эпителий 57
Сетчатка 57
1.1.2. Иммуногистохимический анализ 58
1.2. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки 59
1.2.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 59
1.2.2. Иммуноцитохимический анализ 60
1.3. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза
человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с добавлением ростовых
факторов (bFGF, EGF) и кондиционированной среды 61
1.3.1. Прижизненное наблюдение (фазовая контрастная микроскопия) 61
1.3.2. Иммуноцитохимический анализ 62
2. Исследование пластических способностей клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 65
2.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза
взрослого человека 65
2.1.1. Гистологическое исследование 65
2.1.2. Иммуногистохимический анализ 65
2.1.3 Анализ методом полимеразной цепной реакцией 66
2.2. Характеристика фенотипической пластичности клеток РПЭ глаза взрослого человека, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки 66
2.2.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 66
2.2.2. Иммуноцитохимический анализ 68
2.2.3. Анализ методом полимеразной цепной реакцией клеточных культур ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека 70
2.3. Характеристика фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека, культивируемых в средах, содержащих нейротфические и ростовые факторы (bFGF, EGF, BDNF, CNTF, GNTF) с низким содержанием сыворотки 71
2.3.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 71
Влияние ростовых факторов: основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 71
Влияние нейротрофических факторов: нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) на поведение клеток ретинального пигментного эпителия в селективных культурах 72
2.3.2. Иммуноцитохимический анализ 73
Влияние ростовых факторов основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 73
Влияние нейротрофических факторов нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 74
2.3.3. Колориметрический МТТ тест для оценки метаболической активности клеток 76
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 77
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития in vitro 77
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 78 Иммуноцитохимический анализ и анализ полимеразной цепной реакции клеток ретинального
пигментного глаза человека 79
Влияние факторов на поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 85
Влияние факторов на поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 86
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека I и II субпопуляций 89
Суспензионные культуры клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека 90
Сравнение поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития и глаза взрослого человека in vitro 91
Заключение 94
Выводы 96
Обозначения и сокращения 97
Список литературы 98
