Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Оксид азота как важнейший биологический регулятор физиологических процессов в организме человека и животных 11
1.1.1 Молекулярные механизмы действия оксида азота 12
1.1.2 Синтазы оксида азота и их физиологическая роль в организме .18
1.1.3 Ферментативные и неферментативные механизмы регуляции гомеостаза NO в организме. Эндогенные ингибиторы NO-синтаз 23
1.2 Метилированные производные L-аргинина и их физиологическая роль в организме 26
1.2.1 Источники метилированных производных L-аргинина в организме 31
1.2.2 Пути метаболизма и выведения ADMA и SDMA 33
1.2.3 Клинические состояния, вызванные повышением уровня ADMA и SDMA в плазме крови 39
1.2.4 Модели для изучения физиологической роли асимметричного диметиларгинина .46
1.3 Аланин-глиоксилат аминотрансфераза 2 и ее роль в метаболизме аминокислот .49
1.3.1 Открытие AGXT2 и ее участие в метаболизме глиоксилата 51
1.3.2 Участие AGXT2 в метаболизме метиларгининов 54
1.3.3 Участие AGXT2 в синтезе предшественников гемоглобина 56
1.3.4 Участие AGXT2 в метаболизме бета-аминоизобутирата 57
1.3.5 Другие аминотрансферазные активности AGXT2 59
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1. Генерация трансгенной линии мышей по hAGXT2 61
2.2. Манипуляции с ранними эмбрионами и хирургические процедуры на мышах 63
2.3 Генотипирование мышей 64
2.4 Сбор биологического материала 66
2.5 Клинический анализ крови .66
2.6 Изучение содержания мРНК транскриптов AGXT2, DDAH1 и DDAH2 методом ПЦР в реальном времени 67
2.7 Анализ белковой экспрессии трансгенного hAGXT2 методом Вестерн-блот 70
2.8 Культивирование и инфицирование аденовирусом клеток HUVEC 73
2.9 Выделение и культивирование первичных эндотелиальных клеток трансгенных мышей 74
2.10 Иммуноцитохимическое исследование первичных эндотелиальных клеток трансгенных мышей для изучения локализации трансгенного hAGXT2 75
2.11 Измерение содержания L-аргинина, ADMA, SDMA, ADGV и креатинина в плазме, моче и тканях методом жидкостной хроматографии высокого разрешения-тандем масс-спектрометрии (HPLC-MS/MS 76
2.12 Измерение артериального давления 77
2.13 Физиологическое исследование эндотелиальной функции сосудов ex vivo методом изометрии 78
2.14 Статистический анализ полученных данных 80
Глава 3. Получение линии AGXT2 трансгенных мышей и их общая фенотипическая характеристика 81
3.1 Анализ результатов трансгенеза в линии мышей hAGXT2 81
3.2 Фенотипический анализ трансгенной линии мышей hAGXT2 82
3.3 Клинический анализ крови трансгенной линии мышей hAGXT2 .85
Глава 4. Изучение особенностей экспрессии и локализации трансгенa в различных тканях мышей линии hAGXT2 87
4.1 Анализ экспрессии генов AGXT2, DDAH1, DDAH2 на уровне транскрипции в тканях трансгенных мышей и мышей дикого типа .87
4.2 Анализ белковой экспрессии трансгенного AGXT2 в тканях трансгенных мышей 97
4.3 Изучение клеточной локализации трансгенного hAGXT2 в тканях аорты .102
Глава 5. Изучение биохимических и физиологических особенностей мышей линии hAGXT2 104
5.1 Влияние трансгенной сверхэкспрессии hAGXT2 на метаболизм аргинина, ADMA и SDMA у мышей .104
5.2 Изучение физиологических особенностей сердечно-сосудистой системы трансгенных мышей линии hAGXT2 108
Обсуждение .113
Заключение 116
Выводы 117
Список сокращений и условных обозначений 119
Список литературы 122
Приложение А. Последовательность конструкции, использованной для создания трансгенных мышей по hAGXT2 151
