Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Классическая аффинная модификация 9
1.2. Фотоаффинная модификация 12
1.3. Каталитически компетентное мечение 21
1.4. Каталитически компетентное мечение инициирующего комплекса РНК-полимеразы Escherichia coli 24
1.5. Каталитически компетентное мечение ДНК-полимераз 26
1.6. Фотомодификация с переносом энергии 29
1.7. Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств 32
1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов 35
1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз 37
2. Экспериментальная часть 40
2.1. Материалы 40
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Введение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида 42
2.2.2. Подготовка ДНК-дуплекса к синтезу ДНК, катализируемому ДНК-полимеразами 42
2.2.3. Электрофорез по Леммли 42
2.2.4. Количественная обработка гелей 43
2.2.5. Выделение рекомбинантнойДНК-полимеразы Tte 43
2.2.6. Синтез ДНК, катализируемыйДНК-полимеразой fi илиДНК-полимеразой Tte 43
2.2.7. Определение кинетических параметров 44
2.2.8. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA 44
2.2.9. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз 44
2.2.10. Условия УФ-облучения 45
2.2.11. Оценка эффективности и селективности модификации ДНК-полимераз 45
2.2.12. Выделение ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота 46
2.2.13. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ядерного экстракта 46
2.2.14. Фотоаффинная модификация белков ядерного (клеточного) экстракта 46
2.2.15. Иммуноанолиз антителами против белков репарации 47
3. Результаты и их обсуждение 48
3.1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНК-полимераз 48
3.1.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов dNTP 51
3.1.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В35 53
3.1.3. Влияние природных dNTP на фотосенсибилизированную модификаїїшо ДНК-полимеразы Tte 57
3.1.4. Селективная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA 57
3.1.5. Селективная модификация ДНК-полимеразы а-праймазы 60
3.2. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов 64
3.2.1. Субстратные свойства FAB-4-ddUTP 66
3.2.2. Влияние структуры матрицы на эффективность модификации ДНК-полимеразы Р 68
3.2.3. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модификации ДНК-полимеразы J3 70
3.2.4. Фотоаффинное мечение ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях 10-кратного избытка реакционноспособного праймера 72
3.3. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффинной модификации с использованием различных фотореагентов 74
3.3.1. Структуры ДНК и фотореагентов, использованных в работе 76
3.3.2. Синтез фотореакционноспособных интермедиатов репарации оснований 77
3.3.3. Фотомодификация белков ядерного экстракта 81
3.4. Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте 87
3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНК-структур 88
3.4.2. Сравнение набора продуктов модификации в клеточном и ядерном экстрактах 91
3.4.3. Относительная селективность и эффективность модификации ДНК-полимеразы fie ядерном экстракте 91
Выводы 96
