Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Биосинтез стероидных гормонов 10
1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека -общие стадии 10
1.1.2. Синтез минералокортикоидов 13
1.1.3. Синтез глюкокортикоидов 14
1.1.4. Синтез половых гормонов 14
1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов 15
1.2.1. Адреногенитальный синдром 15
1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы 16
1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы 17
1.3. Особенности структуры и расположения гена CYP21A2 18
1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса 18
1.3.2. Структура RCCX-модуля 20
1.3.3 Структура гена CYP21A2 и псевдогена CYP21AIP 21
1.4. Молекулярно-генетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене CYP21A2 25
1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера 28
1.4.2. Небольшие генные конверсии 29
1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном 30
1.4.4. Возникновение мутаций de novo ЗО
1.4.5. Методы выявления мутаций в гене CYP21A2 31
1.4.6. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 в российской популяции 34
1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците 21-гидроксилазы 35
1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека 39
1.6. Стероид 21-гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р450 43
1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р450 43
1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции 44
1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства цитохромов Р450 47
2. Экспериментальная часть 64
2.1 Пациенты и молекулярно-генетический анализ мутаций 64
2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы 67
2.3. Создание генно-инженерных конструкций и сайт-специфичный мутагенез 68
2.4. Культивирование и трансфекция клеток COS-7 70
2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7 70
2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов 70
2.7. Получение рекомбинантных бакмид 71
2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов 73
2.9. Определение вирусного титра 74
2.10. Экспрессия в клетках насекомых SJ9 и Ш5 75
2.11. Получение микросомных фракций 75
2.12. Анализ каталитической активности в микросомной фракции Ш5 76
2.13. Измерение концентрации белка 76
2.14. ДСН-ПААГ электрофорез 76
2.15. Вестерн-блот-анализ 77
2.16. Иммунофлуоресценция 77
2.17. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 78
2.18. Анализ клонов методом ПЦР 79
2.19. Выделение плазмидной ДНК 79
2.20. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 79
2.21. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле. 80
2.22. Лигирование 80
2.23. Моделирование трехмерной структуры 80
3. Результаты и обсуждение 82
3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP21А2 82
3.2. Экспрессия и функциональный анализ CYP21А2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7 85
3.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 в клетках COS-7 87
3.4. Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы 88
3.5. Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Ш5 92
3.6. Анализ модели трехмерной структуры 96
Заключение 110
Выводы 112
