Введение
Глава 1. Литературный обзор 12
1.1 FoF1- АТФ-синтазный комплекс белков 12
1.1.1 Классификация и эволюция АТФ-синтаз 12
1.1.2 Структура и механизм действия FoF1-АТФ-синтазы 18
1.1.3 FoF1-АТФ-синтазный оперон бактерий 24
1.1.4 Консервативность и вариабельность субъединиц FoF1-АТФ-синтазы бактерий 26
1.1.5 Функции FoF1-АТФ-синтазы .29
1.1.6 Особенности FoF1-АТФ-синтазы Streptomyces 31
1.2 Фосфорилирование АТФ-синтазы 32
1.2.1 Механизмы и функции фосфорилирования белков .34
1.2.2 Фосфорилирование белков у эукариот и прокариот 35
1.2.3 Фосфорилирования субъединиц FoF1-АТФ-синтазы .36
1.3 FoF1-АТФ-синтазы бактерий – как биомишень действия олигомицина .39
1.3.1 Химические модификации олигомицина А .40
1.3.2 Грамположительные бактерии, чувствительные к олигомицину А .44
1.3.3 Механизм действия олигомицина А на FoF1-АТФ-синтазу бактерий .45
Глава 2. Материалы и методы .48
2.1 Штаммы бактерий .48
2.2. Векторы, использованные для клонирования фрагментов ДНК 48
2.3. Культивирование бактерий 49
2.4. Выделение геномной ДНК штамма S. fradiae АТСС 19609 .51
2.5. Амплификация ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) .51
2.6. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля .53
2.7. Выделение плазмидной ДНК из E. coli методом щелочного лизиса 54
2.8. Выделение плазмидной ДНК с использованием набора “Plasmid Miniprep Kit” .54
2.9. Клонирование субъединиц FоF1-АТФ-синтазы 55
2.9.1 Рестрикция .55
2.9.2 Лигирование 55
2.10. Трансформация 56
2.10.1 Получение компетентных клеток E.coli для химической трансформации .56
2.10.2 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК или лигазной смесью .57
2.11. Определение нуклеотидной последовательности отобранных клонов (сиквенс) 57
2.12. Анализ экспрессии генов FоF1-АТФ-синтазы в системе E.coli/BL21(DE3) 57
2.13. Двумерный гель-электрофорез (SDS-PAGE) 60
2.13.1 Состав растворов для проведения двумерного электрофореза белков .60
2.13.2 Приготовление посуды 60
2.13.3 Электрофорез белков в первом направлении 60
2.13.4 Электрофорез белков во втором направлении 60
2.14. Выделение и очистка белков методом металлоаффинной хроматографии с помощью набора Ni-NTA Fast Start Kit (6) («Qiagen») 61
2.15. Количественный анализ белков методом Бредфорд 61
2.16. Получение суммарного препарата СТПК S. fradiae АТСС 19609 63
2.16.1 Получение экстрактов .63
2.16.2.Выделение протеинкиназ 63
2.17 Фосфорилирование субъединиц FoF1-АТФ-синтазы 63
2.18 Получение препаратов мембранных везикул для протеомного анализа .64
2.19 Фосфорилирование белков мембранных везикул 65
2.20 Подготовка образцов для масс-спектрометрии 65
2.21 Получение препаратов инвертированных мембранных везикул S. fradiae для измерения АТФ-синтазной активности .65
2.22 Измерение АТФ-синтазной активности в препаратах инвертированных мембранных везикул S.fradiae ATCC 19609 66
2.23. Биоинформатические методы анализа .67
Глава 3. Результаты и обсуждение .68
3.1 Биоинформатический анализ FoF1-АТФ-синтазы Streptomyces fradiae ATCC 19609 68
3.2 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей субъединиц FоF1 АТФ-синтазы штамма S. fradiae АТСС 19609 с ортологами из белковой базы данных 74
3.3 Получение рекомбинантных белков субъединиц FoF1-АТФ-синтазы S. fradiae ATCC 19609 76
3.4 Фосфорилирование рекомбинантных субъединиц FоF1-АТФ-синтазы S. fradiae АТСС 19609 суммарным препаратом СТПК in vitro .79
3.5 Идентификация фосфорилированных белков во фракции мембранных везикул S. fradiae АТСС 19609 .82
3.6 Определение ингибирующего действия олигомицина А и его производных на активность FoF1-АТФ-синтазы Streptomyces fradiae ATCC 19609 .88
Заключение .95
Выводы .96
Список сокращений 97
Благодарности 98
Список литературы 99
Приложения. 120
