Введение
1. Обзор литературы 10
Плюрипотентные стволовые клетки 10
Генетический контроль раннего эмбрионального развития у млекопитающих 11
Эмбриональные стволовые клетки 14
ЭСК человека в наивном плюрипотентном состоянии 15
Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью 16
Инактивация Х-хромосомы 18
Общие сведения об инактивации Х-хромосомы 18
Экспрессия гена XIST 22
Модификации гистонов неактивной Х-хромосомы 24
Поздняя репликация Х-хромосомы 26
Формирование макрохроматинового тельца и компактной территории 27
Метилирование и гидроксиметилирование ДНК 28
Статус инактивации Х-хромосомы в ПСК человека 29
2. Материалы и методы 33
Культивирование клеточных линий 33
Клеточные линии, использованные в работе 33
Культивирование линий ПСК на матригеле 33
Культивирование линий ПСК на фидере 33
Приготовление фидера 34
Культивирование линий ЭСК в среде NHSM 34
Заморозка и разморозка клеточных линий 34
Культивирование фибробластов 35
Спонтанная дифференцировка ПСК 35
Приготовление цитогенетических препаратов 35
Приготовление препаратов метафазных хромосом ЭСК человека 35
Приготовление препаратов метафазных хромосом соматических клеток 36
Приготовление препаратов метафазных хромосом на цитоспиновой центрифуге 37
Иммуноцитохимическое окрашивание 37
Флуоресцентная гибридизация in situ 38
Флуоресцентная гибридизация in situ – ДНК 38
Флуоресцентная гибридизация in situ – РНК з
Пульс-мечение и детекция времени репликации 39
Детекция времени репликации с использованием 5-бромо-2-дезоксиуридина (BrdU) 39
Пульс-мечение и клик-реакция с 5-этинил-2 -дезоксиуридином (EdU) 40
Микроскопия и фотографирование 40
Алгоритм для сравнения степени компактизации хромосом, расчет дисперсии 40
Выделение геномной ДНК 42
Выделение тотальной РНК, синтез кДНК 42
Полимеразная цепная реакция 42
Полимеразная цепная реакция 43
ПЦР в реальном времени 43
3. Результаты 44
Инактивация Х-хромосомы в ЭСК человека 44
Экспрессия гена XIST 44
Гистоновые модификации Х-хромосомы 44
Экспрессия Х-сцепленных генов 46
Время репликации неактивной Х-хромосомы 47
Гидроксиметлирование ДНК 49
Хромосомные территории как отражение активности Х-хромосомы 51
Инактивация Х-хромосомы в ЭСК при репрограммировании до наивного состояния 53
Характеристика линий чЭСК в «наивных» культуральных условиях 54
Экспрессия гена XIST после культивирования в NHSM условиях 56
Гистоновые модификации после культивирования в NHSM условиях 57
Время репликации Х-хромосомы в NHSM-линиях ЭСК 58
Распределение 5-гмЦ на Х-хромосоме в NHSM-линиях ЭСК человека 60
Статус Х-хромосомы после спонтанной дифференцировки инаивных ЭСК 61
Инактивация Х-хромосомы в плюрипотентных клетках человека, полученных репрограммированием из соматических 62
Экспрессия гена XIST 62
Гистоновые модификации Х-хромосомы 64
Экспрессия Х-сцепленных генов 64
Время репликации неактивной Х-хромосомы 65
Гидроксиметлирование ДНК 66
Формирование компактной территории Х-хромосомы 67
Инактивация Х-хромосомы в ИПСК человека, полученных при репрограммировании в наивных условиях 69
Характеристика линий ИПСК в наивных условиях 69
Гистоновые модификации 69
Сдвиг времени репликации Х-хромосомы 72
4. Обсуждение результатов 73
Вариабельность инактивации Х-хромосомы в ПСК человека. Сравнение ЭСК и иПСК 73
Новые маркеры, отражающие состояния инактивации Х-хромосомы для ПСК человека 76
Гетерогенности между линиями ПСК в наивных условиях плюрипотентности 80
Устойчивое частично активное состояние Х-хромосомы во всех линиях ПСК человека 83
Заключение 85
Выводы 86
Список сокращений 87
Благодарности 88
Список литературы 89
