Введение
1. Обзор литературы .6
1.1. Активные формы кислорода (АФК) и их роль в клетке 6
1.1.1. Основные типы АФК и их источники в клетках 6
1.1.2. Участие АФК в клеточном сигналинге 13
1.1.3. Антиоксидантные системы клеток 17
1.1.4. Химические методы регистрации АФК 25
1.2. Основные редокс пары клетки 33
1.2.1. Соотношение НАД+/НАДН 34
1.2.1.1. Структурные особенности НАД, синтез и транспорт .34
1.2.1.2. Роль НАД+ и НАДН в энергетическом метаболизме клеток 38
1.2.1.3. Другие функции соотношения НАД+/НАДН .39
1.2.1.4. Транскрипционный фактор Rex – природный сенсор соотношения НАД+/НАДН .44
1.2.1.5. Методы регистрации НАД+ и НАДН 47
1.2.2. Соотношение НАДФ+/НАДФН .50
1.2.3. Соотношение GSSG/GSH 51
1.3. Флуоресцентные белки 52
1.3.1. Общие структурные особенности флуоресцентных белков .52
1.3.2. Сенсоры на основе флуоресцентных белков 54
1.3.3. Флуоресцентные сенсоры для регистрации окислительно-восстановительных процессов цели и задачи 62
2. Материалы и методы 63
2.1. Оборудование 63
2.2. Материалы .63
2.3. Методы .66
2.3.1. Методы молекулярного клонирования .66
2.3.2. Методы работы с белком 69
2.3.3. Культура эукариотических клеток 71
2.3.4. Разведение и трансгенез Danio rerio 72
2.3.5. Микроскопия 72
3. Результаты и обсуждение 75
3.1. Усовершенствование генетически кодируемого биосенсора HyPer, созданного для регистрации пероксида водорода 75
3.1.1 HyPer-3 – версия биосенсора, сочетающая в себе полезные качества HyPer и HyPer-2 .76
3.1.2. Сравнение аффинности и скорости реакции полученного HyPer-3 с HyPer и HyPer-2 79
3.1.3. Сравнение спектральных характеристик HyPer-3 с HyPer и HyPer-2 .80
3.1.4. Сравнение олигомерного состояния HyPer-3 с HyPer и HyPer-2 .80
3.1.5. HyPer с объединенными мутациями A406V и H34Y 81
3.1.6. Тестирование HyPer-3 in vivo 82
3.1.7. Использование HyPer-3 и HyPer в FLIM микроскопии 83
3.2. Создание генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора для
регистрации соотношения НАД+/НАДН 86
3.2.1. Конструкция и спектральные характеристики RexYFP 86
3.2.2. Определение чувствительности RexYFP 89
3.2.3. Подбор рН-контроля при работе с биосенсором RexYFP в живых системах 91
3.2.4. Использование RexYFP в клетках эукариот 92
3.2.5. Сравнение окислительно-восстановительного состояния пула НАД в цитоплазме и матриксе митохондрий с помощью RexYFP .94
3.2.6. RexYFP по отношению к другим биосенсорам, регистрирующих соотношение НАД+/НАДН 96
Выводы .98
Заключение 99
Список сокращений 102 список литературы 105
