Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Энтеровирусы: общая характеристика 13
1.1.1 Строение капсида и организация генома 13
1.1.2 Цикл репликации 14
1.1.3 Транскрипция генома 14
1.1.4 Трансляция генома пикорновирусов 15
1.1.5 Процессинг полипротеина 15
1.1.6 Функции неструктурных вирусных белков 16
1.1.7 Сборка вирусных частиц 17
1.2 Рецепторы энтеровирусов 18
1.2.1 Полиовирусный рецептор (PVR/CD155) 18
1.2.2 Рецептор вирусов Коксаки и аденовирусов (CXADR/CAR) 24
1.3 Механизм действия энтеровирусов 29
1.3.1 Ингибирование транскрипции и трансляции клеток-хозяев 29
1.3.2 Гибель клеток 30
1.3.3 Ответ иммунной системы на энтеровирусную инфекцию 31
1.4 Онколитические вирусы в терапии глиом 35
1.4.1 Онколитические вирусы на основе вакцинных и непатогенных или слабопатогенных для человека штаммов 38
1.4.2 Онколитические вирусы на основе патогенных вирусов животных 42
1.4.3 Онколитические вирусы на основе вирусов, патогенных для человека 45
1.5 Онколитические энтеровирусы 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 55
2.1 Реактивы и расходные материалы 55
2.1.1 Реактивы 55
2.1.2 Штаммы Escherichia coli и плазмиды 56
2.1.3 Олиго- и полинуклеотиды 56
2.2 Вирусы и клетки 56
2.2.1 Вирусы 56
2.2.2 Культуры клеток 57
2.3 Оборудование 58
2.4 Методы 58
2.4.1 Конструирования лентивирусного вектора 58
2.4.2 Получение лентивирусных стоков 61
2.4.3 Лентивирусная трансдукция клеток и селекция на пуромицине 61
2.4.4 Конструирование плазмиды для нокаута гена интерферонового рецептора Ifnar1 и введение в клетки С6-PVR-BFP 62
2.4.5 Иммуноцитохимия, проточная иммуноцитометрия и сортировка клеток 62
2.4.6 Наработка и очистка вирусных стоков, определение титра 63
2.4.7 Анализ жизнеспособности клеток после инфицирования вирусами 64
2.4.8 Анализ вирусной репродукции в инфицированных клетках 64
2.4.9 Тест на обработку интерфероном 65
2.4.10 Оценка характеристики роста клеток в режиме реального времени с использованием клеточного анализатора xCELLigence 65
2.4.11 Выделение тотальной РНК и синтез кДНК 65
2.4.12 Определение относительного количества мРНК интерферона и методом ПЦР в режиме реального времени 65
2.4.13 Выделение геномной ДНК 67
2.4.14 Подготовка образцов и секвенирование 67
2.4.15 Моделирование и терапия подкожных ксенографтов 68
2.4.16 Моделирование ортотопической глиобластомы у крыс и магнитно резонансная томография (МРТ) 68
2.4.17 Завершение эксперимента на животных 69
2.4.18 Статистическая обработка 69
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1 Получение гуманизированной линии клеток глиомы С6 крысы, экспрессирующих гены PVR или CXADR человека 70
3.2 Исследование чувствительности гуманизированных линий глиомы С6 к непатогенным энтеровирусам человека 75
3.3 Исследование репродукции непатогенных штаммов энтеровирусов человека на гуманизированных линиях глиомы С6 крысы 80
3.4 Изучение зависимости онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека от состояния сигнальных путей интерферонового ответа гуманизированных клеток глиомы С6 84
3.5 Сравнение динамики роста гуманизированных клеток глиомы C6 in vitro и in vivo на крысах при интракраниальной имплантации в мозг крыс 91
3.6 Оценка онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека на модели подкожных ксенографтов гуманизированных клеток глиомы C6 на иммунодефицитных мышах 97
Заключение 101
Выводы 104
Благодарности 105
Список сокращений 106
Список литературы 108
