Введение
ГЛАВА I Обзор литературы. 40
1.1. Факторы риска мультифакторных (комплексных) заболеваний.
1.1.1. Наследственная составляющая мультифакторных заболеваний .
1.1.2. Генетический полиморфизм. 42
1.1.3. Однонуклеотидные замены. 42
1.1.4. Экзогенные факторы риска мультифакторных заболеваний и эпигенетическая регуляция экспрессии генов.
1.1.5. Заключение. 45
1.2. Методы картирования генов-кандидатов мультифакторных заболеваний.
1.2.1. Основные подходы. 45
1.2.2. Анализ функциональных ассоциаций. 47
1.2.3. Полногеномный анализ ассоциаций и сцепления. 49
1.2.4. Полногеномное секвенирование. 51
1.2.5. Анализ транскриптома. 52
1.2.6. Анализ эпигенома. 53
1.2.7. Генные сети и компьютерная геномика. 54
1.2.8. Системно-генетический подход. 56
1.2.9. Заключение. 57
1.3. Методы детекции мутаций. 57
1.3.1. ДНК-биочипы. 59
1.3.1.1. Типы биочипов. 59
1.3.1.2. Биочипы «низкой плотности». 60
1.3.1.3. Биочипы «высокой плотности». 63
1.3.1.4. Заключение. 63
1.3.2. Технология полногеномного секвенирования. 63
1.3.3. Заключение. 66
1.4. Методы и подходы для оценки риска наследственной предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.
1.4.1. Межгенные взаимодействия. 66
1.4.2. Эффекты эпистаза. 68
1.4.3. Генетика количественных признаков и оценка риска мультифакторных заболеваний .
1.4.4. Биоинформатический подход. Анализ генных сетей. 71
1.4.5. Оценка индивидуального риска с помощью математической ст атистики.
1.4.6. Математическое моделирование признаков (заболеваний) человека на основе множественной информации.
1.4.6.1. Байесеновская модель. 75
1.4.6.2. Множественное снижение размерности. 76
1.4.6.3. Линейная модель. 77
1.4.6.4. Статистические интернет-ресурсы. 79
1.4.7. Предсказательная сила генетического тестирования.
1.4.7.1. ROC кривые. 80
1.4.7.2. Оценка эффективности генетических исследований как диагностических тестов.
1.4.7.3. Клиническая значимость результатов исследования.
1.4.8. Заключение. 84
1.5. Частые мультифакторные заболевания с гипертензивным синдромом.
1.5.1. Акушерская патология. Гестоз. Генетические факторы риска гестоза.
1.5.1.1. Гены «тромбофилии». 91
1.5.1.1.1. Ген фактора 5 свертывания крови. 93
1.5.1.1.2. Ген фактора 2 свертывания крови (протромбина). з
1.5.1.1.3. Ген -субъединицы фибриногена. 93
1.5.1.1.4. Ген гликопротеина 3a. 94
1.5.1.1.5. Ген ингибитора активатора плазминогена 1 типа. 94
1.5.1.1.6. Ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы. 95
1.5.1.2. Гены регуляции «артериального давления» и «эндотелиальной дисфункции».
1.5.1.2.1. Ангиотензиноген. 96
1.5.1.2.2. Ангиотензинпревращающий фермент. 97
1.5.1.2.3. Рецептор 1 к ангиотензину II. 98
1.5.1.2.4. Рецептор 2 к ангиотензину II. 99
1.5.1.2.5. Эндотелиальная NO синтаза. 99
1.5.1.3. Гены «метаболизма липидов». 100
1.5.1.3.1. Ген липопротеинлипазы. 100
1.5.1.3.2. Ген аполипопротеина E.
1 1.5.1.4. Гены гестоза, выявленные с помощью метода полногеномного скрининга ассоциаций.
1.5.1.5. Изменение уровня микроРНК. 103
1.5.1.6. Эпигенетические маркеры риска развития гестоза. 105
1.5.2. Артериальная гипертензия. Генетические факторы риска артериальной гипертензии.
1.5.2.1. Ренин-ангиотензиновая и кинин-брадикининовая системы. 109
1.5.2.1.1. Ренин. 111
1.5.2.1.2. Рецептор 2 к брадикинину. 112
1.5.2.1.3. Другие гены.
1 1.5.2.2. Метаболизм липидов. 112
1.5.2.3. Обмен гомоцистеина. 113
1.5.2.4. Бета-адренорецепторы. Ген 2 адренорецептора. 113
1.5.2.5. Гены артериальной гипертензии, установленные методом полногеномного скрининга ассоциаций.
1.5.2.6. Другие гены-кандидаты. 115
1.5.3. Метаболические болезни. Генетические факторы риска ожирения и метаболического синдрома.
1.5.4. Заключение. Общие гены-кандидаты, ассоциированные с риском развития гестоза, артериальной шипертензии и метаболического синдрома с ожирением.
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. 129
2.1. Создание коллекций образцов и формирование клинических групп.
2.2. Выделение геномной ДНК. 133
2.2.1. Экстракция ДНК из лимфоцитов периферической крови. 133
2.2.2. Экстракция ДНК из клеток буккального эпителия. 133
2.2.3. Экстракция ДНК из ворсин плаценты.
2.3. Обработка ДНК бисульфитом натрия. 133
2.4. Экстракция микроРНК. 134
2.5. Обратная транскрипция и получение кДНК. 134
2.6. ПЦР/ПДРФ анализ.
2.6.1. Выбор праймеров. 134
2.6.2. Амплификация фрагментов ДНК. 135
2.6.3. Обработка эндонуклеазами рестрикции. 136
2.6.4. Визуализация ПЦР-продуктов. 137
2.7. Анализ однонуклеотидных замен методом гибридизации на ДНК-биочипе.
2.7.1. Выбор праймеров и олигонуклеотидов. 139
2.7.2. Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов. 143
2.7.3. Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.
2.7.4. Визуализация ПЦР-продуктов в агарозном геле. 145
2.7.5. Гибридизация меченого продукта на биочипе. 146
2.7.6. Регистрация изображения на биочипе и его обработка. 147
2.8. Анализ метилирования остатков цитозина в ДНК. 149
2.8.1. Метилчувствительная ПЦР. 150
2.8.2. Метилспецифичная ПЦР. 151
2.8.3. Комбинированный бисульфитно-рестрикционный анализ. 152
2.9. Массовое параллельное секвенирование ДНК/РНК. 152
2.9.1. NGS секвенирование на приборе «Ion Torrent». 152
2.9.1.1. Создание ДНК-библиотек протяженных фрагментов ДНК методом «удлиняющей» ПЦР.
2.9.1.2. Создание библиотек микроРНК. 157
2.9.1.3. Эмульсионная ПЦР. 160
2.9.1.4. «Обогащение» микросфер. 160
2.9.1.5. Секвенирование на микрочипах. 162
2.9.1.6. Анализ полученных данных. 165
2.9.2. NGS секвенирование на приборе «GS Junior». 165
2.9.2.1. Создание ДНК-библиотек. 165
2.9.2.2. Подготовка библиотек для секвенирования 165
2.9.2.3. Секвенирование на микрочипах. 166
2.9.2.4. Анализ полученных данных. 166
2.9.3. Обработка полученных данных. 166
2.10. Построение ассоциативных сетей. 167
2.11. Статистическая обработка данных. 170 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 172
3.1. Разработка биочип-тест-систем для анализа генетического 172
полиморфизма.
3.1.1. Система свертывания крови – «Фибр-биочип». 172
3.1.1.1. Выбор генов и полиморфных вариантов. 172
3.1.1.2. Схема микрочипа. 172
3.1.1.3. Анализ контрольных и диагностических образцов. 174
3.1.2. Заключение. 174
3.2. Исследование генов-кандидатов и поиск новых генетических маркеров гестоза, артериальной гипертензии и ожирения с метаболическим синдромом.
3.2.1. Наследственные маркеры гестоза. 175
3.2.1.1. Молекулярно-генетические маркеры гестоза. 175
3.2.1.1.1. Частоты аллелей и их комбинаций по 16 генам-кандидатам у 175
женщин с гестозом, в группе сравнения и у доноров.
3.2.1.1.2. Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций 179
генов-регуляторов артериального давления, свертывания крови и
липидного обмена у женщин с гестозом, в контрольной группе
беременных и у доноров.
3.2.1.1.3. Анализ ассоциации изученных аллелей с показателями 187
артериального давления и концентрацией белка в моче у женщин с гестозом.
3.2.1.1.4. Математические модели риска гестоза. 191
3.2.1.1.4.1. «Бальный» подход. 191
3.2.1.1.4.2. Метод MDR. 193
3.2.1.1.4.3. GLM модель. 196
3.2.1.1.4.4. Эффективность предсказания фенотипа при совместном учете генетических и клинических показателей (ROC-анализ).
3.2.1.2. Поиск новых генетических маркеров. 201
3.2.1.2.1. Генная сеть гестоза. 201
3.2.1.2.1.1. Реконструкция первичной генной сети гестоза. Гестозосома.
3.2.1.2.1.2. Реконструкция первичных ассоциативных сетей молекулярных механизмов, общих для гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных.
3.2.1.2.1.3. Реконструкция ассоциативных связей гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных с помощью программ «ANDSystem» и «STRING».
3.2.1.2.1.4. Анализ сверхпредставленности биологических процессов. 212
3.2.1.2.1.5. Реконструкция ассоциативных сетей гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных на основании данных сверхпредставленности биологических процессов.
3.2.1.2.2. Секвенирование гена ACVR2A у женщин с гестозом и у женщин с физиологической беременностью.
3.2.1.2.2.1. Поиск клинически значимых нуклеотидных замен в гене ACVR2A у женщин с гестозом.
3.2.1.2.2.2. Анализ корреляции комбинаций аллелей гена ACVR2A с показателями САД, ДАД, и концентрацией белка в моче беременных женщин с гестозом.
3.2.1.2.2.3. Анализ ассоциации комбинаций аллелей гена ACVR2A с наличием отеков, сопутствующих патологий и тяжестью манифестации заболевания у беременных женщин с гестозом
3.2.1.2.2.4. Сравнительный анализ результатов секвенирования гена 224 ACVR2A у женщин с гестозом и в контрольной группе.
3.2.1.2.3. Сравнительный анализ уровня микроРНК в плаценте у 228 больных гестозом и при нормальной беременности.
3.2.1.2.4. Исследование метилирования промоторных регионов гена 234 H19 в плаценте при гестозе и в контроле.
3.2.1.3. Заключение. 237
3.2.2. Наследственные маркеры артериальной гипертензии и метаболического синдрома с ожирением у детей.
3.2.2.1. Изучение молекулярно-генетических маркеров у детей с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
3.2.2.1.1. Исследование частот аллелей генов и их комбинаций с использованием «Кардио-биочипа» и методом ПЦР-ПДРФ.
3.2.2.1.2. Сравнительный анализ частот аллелей генов и их 241
комбинаций, вовлеченных в регуляцию артериального давления.
3.2.2.1.3. Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и вариантов генов у детей с артериальной гипертензией.
3.2.2.1.4. Анализ ассоциации ИМТ, САД, ДАД и вариантов генов у детей с метаболическим синдромом и ожирением.
3.2.2.1.5. Создание математических моделей риска артериальной гипертензии и метаболического синдрома с ожирением.
3.2.2.1.5.1. «Бальная» оценка риска артериальной гипертензии. 262
3.2.2.1.5.2. «Бальная» оценка риска метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.1.5.3. MDR подход для оценки риска артериальной гипертензии. 263
3.2.2.1.5.4. MDR подход для оценки риска метаболического синдрома 273 и ожирения.
3.2.2.1.5.5. GLM модель для оценки риска артериальной гипертензии. 282
3.2.2.1.5.6. GLM модель для оценки риска метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.1.5.7. Эффективность предсказания фенотипа на основании генетических и клинических показателей (ROC-анализ).
3.2.2.2. Поиск новых генетических маркеров артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.2.1. Реконструкция первичной генной сети артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.2.2. Исследование аллельных вариантов генов CDH13 (rs11646213 A/T), MTHFR (rs17367504 A/G), CDKN2/BAS (rs4977574 A/G), а также маркера (rs11191548 T/C) в качестве кандидатов риска гипертонии.
3.2.2.3. Заключение. 303
ГЛАВА 4 Обсуждение 305
4.1. Оценка преимуществ метода гибридизации на биочипах для изучения генетического полиморфизма человека.
4.1.1. Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическими методами анализа.
4.1.2. Перспективы использования «Фибр-биочипа». 307
4.1.3. Сравнение «биочиповых» технологий с методами полногеномного секвенирования.
4.1.4. Перспективы биочипов «низкой плотности». 309
4.2. Оценка роли генетических маркеров в развитии 310
мультифакторных заболеваний.
4.2.1. Вклад однонуклеотидных замен. 311
4.2.1.1. Оценка эффективности ассоциативных исследований геновкандидатов.
4.2.1.1.1. Риск гестоза. 311
4.2.1.1.2. Риск артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
4.2.1.2. Эффективность полногеномного скрининга для оценки риска артериальной гипертензии у детей.
4.2.1.3. Корреляционный анализ генетических и клинических показателей.
4.2.1.4. Оценка риска гестоза, артериальной гипертензии, а также метаболического синдрома с ожирением с помощью математических моделей.
4.2.1.4.1. Анализ «суммы баллов комбинации аллелей». 321
4.2.1.4.2. Метод множественного снижения размерности. 321
4.2.1.4.3. Линейная модель. 322
4.2.1.4.4. Заключение. 324
4.2.2. Поиск новых маркеров риска мультифакторных заболеваний . 326
4.2.2.1. Вклад генных сетей в идентификацию новых биомаркеров. 326
4.2.2.1.1. Анализ ассоциативной сети гестоза. 326
4.2.1.1.2. Анализ ассоциативной сети артериальной гипертензии, метаболического синдрома и ожирения.
4.2.1.1.3. Недостатки и преимущества биоинформатических исследований с помощью генных сетей для изучения наследственной предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.
4.2.2.2. Вклад полногеномного секвенирования гена для оценки риска 10 гестоза.
4.2.2.3. Оценка уровня микроРНК для предсказания риска развития гестоза.
4.2.2.4. Использование эпигенетических маркеров для оценки риска развития гестоза.
Заключение. 348
Выводы. 356
Практические рекомендации. 358
Список литературы
