Введение
1. Интерференция РНК и ее применение в молекулярной биологии 9
1.1. Феномен интерференции РНК 9
1.2. Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК 12
1.3. Особенности протекания процесса интерференции РНК в клетках млекопитающих 23
1.4. Роль интерференции РНК в жизнедеятельности клетки 29
1.5. Характеристика систем осуществления интерференция РНК в клетках высших эукариот 33
1.5.1. Химический синтез 35
1.5.2. Транскрипция in vitro 36
1.5.3. Получение интерферирующих РНК с помощью фермента Diser .37
1.5.4. Экспрессионные векторы 39
1.6. Примеры использования интерференции РНК в молекулярной биологии 45
2. Генетический "нокдаун" протимозина альфа человека методом интерференции РНК 51
2.1. Осуществление протимозин альфа-специфичной интерференции РНК в клетках человека 53
2.1.1. Конструирование плазмид для осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа в клетках человека 54
2.1.2. Оптимизация условий интерференции РНК протимозина альфа 58
2.2. Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК 65
2.2.1. Оценка снижения количества мРНК протимозина альфа в клетках HeLa, трансфицированных pSuperRNAi-ProTa 65
2.2.2. Специфичность использованных интерферирующих РНК 67
2.2.3. Оценка снижения экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта 69
2.3. Специфичность эффекта снижения экспрессии гена протимозина альфа 79
2.4. Исследование участия протимозина альфа в ответе клетки на окислительный стресс 80
3. Экспериментальная часть 86
3.1. Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и реактивы 86
3.2. Используемые методы 88
3.3. Манипуляции с клетками млекопитающих 93
3.4. Конструирование плазмид 102
Выводы 105
