Введение
Обзор литературы 9
1. НАДН цитохром в5 редуктаза/цитохром В5 9
1.1. НАДН цитохром Ь5 редуктаза 9
1.1.1. Биохимические, ре доке-свойства 11
1.2. Цитохром b5 11
1.3. Функции системы цитохром b5 редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий: установленные, предполагаемые, артефактные 13
1.3.1. НАДН семидегидроаскорбат редуктазная активность 15
1.3.2. НАДН аквакобаламин редуктазная активность
1.3.3. Предполагаемые антиоксидантные и прооксидантные функции системы цитохром Ъ5редуктазы/цитохрома bs внешней мембраны митохондрий 16
1.3.4. Участие CybsR-CybsOM системы в метаболизме стероидных гормонов и липидном обмене 17
1.4. Стресс-индуцированный «внешний путь окисления НАДН» и его возможные функции 18
1.4.1. Модели функционирования «внешнего пути» 19
1.4.2. Би-трансмембранная модель 20
1.4.3. Предполагаемые функции «внешнего пути» 21
2. Потенциал зависимый анионный канал (VDАС 1) 22
2.1. Структура VDAC 22
2.2. Регуляция метаболизма митохондрий 22
3. «Тканеспецифичная» ротенон-чувствительная надн убихинон (цитохром с) редуктаза 25
4. Апоптоз индуцирующий фактор (ALF) 28
4.1. Экспрессия ALF 29
4.2. Локализация ALF 29
4.3. Структура ALF 29
4.4. Редокс-свойства/биохимические свойства 31
4.5. Физиологическая роль ALF митохондриях 33
5. Методы регистрации активности надн-зависимых редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий 34
6. Ксенобиотики, использованные в работе в качестве акцепторов 35
6.1. Менадион 35
6.2. Нитрофурантоин 36
6.3. Паракват 36
6.4. Доксорубицин 37
6.5. Даунорубицин 38
6.6. Арсеназо III 38
6.7. Люцигенин 38
Материалы и методы 40
1. Культуры клеток 40
1.1. Выделение нейтрофилов из крови крыс 40
1.2. Выделение крысиных перитонеальных макрофагов 40
1.3. Выделение кардиомиоцитов крысы 41
1.4. Оценка цитотоксичности 41
2. Получение гомогенатов и срезов ткани, выделение митохондрий 42
2.1. Приготовление гомогенатов печени и почек крысы 42
2.2. Выделение интактных митохондрий из печени крыс
2.2.1. Моделирование повреждения митохондриальных мембран 43
2.2.2. Оценка количества повреждённых митохондрий после выделения 43
2.2.3. Определение количества белка 44
2.3. Приготовление тонких срезов мозга крысы 44
3. Измерение продукции активных форм кислорода 44
4. Методы оценки основных параметров, характеризующих функциональное состояние изолированных митохондрий 45
4.1. Измерение объёма митохондриального матрикса 45
4.2. Установка для одновременной регистрации изменений концентрации различных ионов в среде инкубации и скорости потребления кислорода митохондриями
4.2.1. Измерение трансмембранного потенциала изолированных митохондрий 46
4.2.2. Измерение максимальной кальциевой емкости 46
4.2.3. Состояние системы окислительного фосфорилирования 47
4.3. Регистрация окисления пиридиннуклеотидов 48
5. Регистрация восстановления используемых акцепторов 48
5.1. Восстановление цитохромов с и bs 48
5.2. Восстановление ксенобиотиков 49
5.2.1. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в интактных и пермеабилизованных клетках 49
5.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии 50
5.2.3. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в гомогенатах тканей 50
6. Статистическая обработка 51
7. Материалы 51
Результаты и обсуждение 52
1. Разработка методов оценки активности надн-зависимых редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий в митохондриальных и клеточных системах 52
1.1. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по окислению добавленного НАДН 52
1.2. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по восстановлению люцигенина до диметилбиакридена 1.2.1. Анализ продукции ДБА НАД(Ф)Н оксидоредуктазами в пермебилизованных клетках НЕр-2 с помощью проточной цитометрии 64
1.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии 67
1.2.3. Визуализация сайтов с высокой НАДН оксидоредуктазной активностью на срезах мозга 69
1.2.4. Анализ активности НАДФН оксидаз плазматической мембраны макрофагов и нейтрофилов и гомогената почек 69
1.3. Регистрация активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по
генерации активных форм кислорода в присутствие автоокисляющихся акцепторов.73
2. Роль НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий в генерации афк и индукции са-зависимой неспецифической поры (мРТР) 79
2.1. Продукция АФК суспензией митохондрий при добавлении внешнего НАДН 79
2.2. Открытие поры в присутствии ксенобиотиков и внешнего НАДН 82
3. Идентификация НАДН-зависимой оксидоредуктазы, ответственной за
активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий 83
3.1. Проверка гипотезы о существовании тканеспецифичной ротенон-чувствительной НАДН - оксидоредуктазы во внешних отделах митохондрий сердца 83
3.2. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на проницаемость внутренней и внешней митохондриальных мембран для ионов, растворов и субстратов 84
3.3. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на активность цитохром bs редуктазы 3 88
3.4. Эффект блокаторов VDAC и ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 на активность внешней редуктазы ксенобиотиков 89
3.5.Эффект блокаторов VDAC на скорость окисления НАДН в присутствии рекос активных соединений 91
3.6. Эффект ионной силы среды на продукцию АФК внешними НАДН оксидоредуктазами в присутствии редокс-активных соединений 92
3.7. Эффект антител к VDAC и цитохром bs редуктазе на цитохром с - и люцигенин-редуктазную активность 93
3.8. Эффект нитрофурантоина, ингибиторов цитохром bs редуктазы 3 и блокаторов VDAC 1 на окислительно-восстановительное состояние эндогенных цитохромов bs и с 95
Заключение 99
Выводы 100
Список литературы
