Введение
Глава 1. Макролидные антибиотики 13
1.1. Механизм действия антибиотиков различных химических классов 13
1.2. Макролидные антибиотики - их классификация, механизмы действия 15
1.3. Макролидные антибиотики класса олигомицинов 16
1.4. Streptomyces fradiae как продуцент макролидного антибиотика тилозина 18
Глава 2. Механизмы устойчивости к макролидным антибиотикам 20
2.1. Механизмы возникновения устойчивости к макролидным антибиотикам 20
2.2. Метилирование рибосомального сайта связывания антибиотика 22
2.3. Возникновение мутации в сайте связывания 23
2.4. Выброс антибиотика из клетки 23
2.5. Модификация антибиотиков в клетке 27
2.6. Устойчивость к макролидным антибиотикам S. fradiae, обусловленная
способностью продуцировать тилозин 28
Глава 3. Известные механизмы действия олигомицина А на эукариотческие и бактериальные клетки 30
3.1. АТФ-синтаза - биомишень действия олигомицина А у эукариот 30
3.2. Классификация различных АТФ-синтаз 31
3.3. ЕоБ1- АТФ-синтаза 32
3.4. Механизм синтеза и гидролиза АТФ 34
3.5. АТФ-синтаза как перспективная биомишень 37
3.6. Механизм связывания олигомицина А и C-субъединицы ЕоБ1-АТФ синтазы 38
Глава 4. Антибиотики группы олигомицинов. Механизмы чувствительности актинобактерий 42
4.1. Антибиотик олигомицин А и его производные, механизмы их действия у актинобактерий 42 4.2. Чувствительность и устойчивость к олигомицину А бактерий, включая актинобактерии 45
4.3. Тест система на основе S. fradiae ATCC 19609 для определения активности производных олигомицина А и поиска новых возможных биомишеней 46
4.4. Противоопухолевая активность олигомицина А и его производных 48
Глава 5. Существующие подходы поиска новых биомишеней 50
5.1. Понятие биомишени при создании лекарственных средств 50
5.2. Лекарственные средства и классификация их биомишеней 51
5.3. Проблема поиска новых биомишеней 53
Глава 6. Материалы и методы 54
6.1. Штаммы бактерий 54
6.2. Олигонуклеотиды, использованные в работе 54
6.3. Культивирование бактерий 56
6.4. Методика определения антибактериальной активности веществ 57
6.5. Получение штаммов S. fradiae ATCC 19609, устойчивых к производным олигомицина А 57
6.6. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 58
6.6.1. Выделение тотальной ДНК 58
6.6.2. Выделение РНК 58
6.6.3. Полногеномное секвенирование полученного штамма 59
6.6.4. Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля 59
6.6.5. Очистка ДНК из реакционной смеси 59
6.6.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 59
6.6.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 60
6.6.8. Определение количества ДНК 60
6.7. Манипуляции с белками 61
6.7.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях 61
6.7.2 Двумерный электрофорез и масс-спектрометрический анализ 61
6.8. Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени 62
6.9. Биоинформатические методы 62
6.10. Получение препаратов инвертированных мембранных везикул S. fradiae
ATCC 19609 63
6.11. Измерение АТФ-синтазной активности в препаратах инвертированных мембранных везикул 64
Глава 7. Результаты и обсуждение 66
7.1. Экспериментальная схема исследования 66
7.2. Характеристика спектра устойчивости штамма S. fradiae ATCC 19609 к
антибиотикам различных химических классов 68
7.3. Характеристика устойчивости штамма S. fradiae ATCC 19609 к
олигомицину А и его производным 70
7.4. Определение ингибирующего действия олигомицина А на активность FоF1 ATФ-синтазы в везикулах S. fradiae ATCC 19609 77
7.5. Определение уровня чувствительности (устойчивости) к новым производным олигомицина А на линии культур клеток 81
7.6. Полногеномное секвенирование генома S. fradiae ATCC 19609 82
7.7. Аннотация генов устойчивости к антибиотикам в геноме S. fradiae ATCC
19609 и выявление их ортологов в геноме S. lividans TK24 и S. albus J1074 83
7.8. Получение мутантов штамма S. fradiae ATCC 19609, устойчивых к производным олигомицина А 88
7.8.1. Получение и характеристика tcnR+ мутанта устойчивого к (33S)-33 дезокси-33-тиоцианатоолигомицину у S fradiae ATCC 19609 90
7.8.2. Получение и характеристика nitR+ мутанта, устойчивого к нитрон олигомицину А, S. fradiae ATCC 19609 91
7.9. Полногеномное секвенирование мутанта, устойчивого к (33S)-33-дезокси 33-тиоцианатоолигомицину S. fradiae tcnR+ 92
7.10. Изучение функции гена хеликазы у мутантного штамма S. fradiae tcnR+ 93
7.10.1. Биоинформатический анализ гена хеликазы штамма S. fradiae ATCC
19609 94
7.11. Полногеномное секвенирование мутанта, устойчивого к нитрон олигомицину S. fradiae-nitR+bld 97
7.12. Характеристика мутантного штамма S. fradiae-nitR+bld. Протеомный и
транскрипционный анализ 98
7.12.1. Распространение и функции генаpadR у Грам+ бактерий 99
7.12.2. Сравнительный протеомный анализ мутантног штамма S. fradiae nitR+bld и исходного штамма S. fradiae ATCC 19609 101
7.12.3 Изучение уровня экспрессии генов, ответственных за nitR и bald фенотип, у мутантного штамма S. fradiae-nitR+bld и исходного штамма S. fradiae ATCC 19609 методом ПЦР в реальном времени 103
7.12.4. Изучение уровня экспрессии гена marR S. fradiae-nitR+bld и S. fradiae
ATCC 19609 при индукции нитрон-олигомицином 105
7.12.5. Предполагаемая схема участия транскрипционного регулятора PadR в регуляции других генов у S. fradiae ATCC 19609 107
Заключение 110
Выводы 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
