Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1.Искусственная эволюция белков 10
1.1.1. Цели и задачи искусственной эволюции белков 11
1.1.2. Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза 14
1.1.2.1. Радиационный и химический мутагенез 14
1.1.2.2. Метод подверженной ошибкам ПНР 15
1.1.3. Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза 16
1.1.3.1. Сайт-специфический мутагенез 16
1.1.3.2. Сайт-сосредоточенный мутагенез 17
1.1.3.3. Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами 17
1.1.4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза 22
1.1.4.1.Метод перетасовки ДНК 22
1.1.4.2. Метод геномной перетасовки 25
1.1.4.3. Метод прерывистой элонгации 26
1.1.4.4. Случайное образование химерных молекул на временной матрице 27
1.1.4.5. Гетеродунлекс 28
1.1.4.6. Сборка соответствующих олигонуклеотидов 28
1.1.4.7. Мутагенная и однонаправленная повторная сборка 29
1.1.4.8. Метод экзонной перетасовки 30
1.1.4.9. Негомологичная рекомбинация 31
1.2. Аллостерические ферменты 32
1.2.1. Аллостерическая регуляция 32
1.2.2. Ретроингибирование 34
1.2.3. N-ацетилглутамат-синтетаза 36
1.2.4. N-ацетилглутамат киназа 39
1.2.5. Карбамоилфосфат синтетаза 40
1.2.5.1. Механизм действия CPSase 40
1.2.5.2. Аллостерическая регуляция CPSase 44
1.2.5.3. Регуляция транскрипции оперонасагАВ 46
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1.Бактериальные штаммы 48
2.1.1. Конструирование штамма B7::argA-ral3::argGH 48
2.2. Среды и условия культивирования штаммов 49
2.2.1. Условия культивирования штаммов TG1, В16-4, В3083 и В6969 49
2.2.2. Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина 49
2.3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК 50
2.3.1. Генно-инженерные методики 50
2.3.2. Конструирование плазмиды pUCl 8-argI 52
2.3.3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt 53
2.3.4. Конструирование плазмиды pM!V-5-Pi-argA-ml3 53
2.3.5. Конструирование плазмиды pMIV-5-PrargGH 54
2.3.6. Конструирование плазмиды pET-Piac 55
2.3.7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt 55
2.3.8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ 56
2.4. Создание библиотек мутантных генов 56
2.4.1. Создание библиотеки мутантных argA генов 56
2.4.2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов 57
2.5. Отбор активных мутантов , 59
2.5.1. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках Е. соН штамма TG1 59
2.5.2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E.coliBl 6-4...59
2.5.3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase 59
2.6. Выделение и очистка белка NAGS 60
2.7. Измерение ферментативных активностей 62
2.7.1. Анализ ферментативной активности мутантных NAGS 62
2.7.2, Анализ ферментативной активности мутантных CPSase 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Метод комбинаторного мутагенеза 65
3.2. Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы 68
3.2.1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA 68
3.2.2. Селекция "активных вариантов" мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма TG1 69
3.2.3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16-4 69
3.2.4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах 70
3.2.5. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS 72
3.2.6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина 77
3.3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. coli 78
3.3.1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ 79
3.3.2. Селекция fbr мутантов CPSase 80
3.3.3. Применение полученных Пэг-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты 85
3.3.4. Применение полученных fbr-мутаитов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента аргинина 87
Выводы 90
Список литературы 91
