Введение
2. Ретротранспозоны (обзор литературы) 9
2.1.Классификация мобильных элементов дрозофилы 9
2.2. Строение ретротранспозонов 11
2.2.1. Особенности строения не-ДКП-ретротранспозонов 11
2.2.2. Структурная характеристика ДКП-ретротранспозонов... 14
2.3. Роль ретротранспозоиов в функционировании генома 17
2.3.1. Ретротранспозоны как фактор поддержания целостности генома... 17
2.3.2. Ретротранспозоны как фактор генетической изменчивости 18
2.4. Ретротранспозон МДГ4 и генетическая нестабильность 20
2.4.1. Структура ретротранспозона МДГ4 20
2.4.1.1. Белковые продукты открытых рамок считывания МДГ4. 22
2.4.1.1.1. Ген gag и его продукты 22
2.4.1.1.2. Геи pot и его продукты 23
2.4.1.1.3. Ген елV. 26
2.4.2. Генетическая нестабильность в мутаторной линии MS Drosophita melanogaster. 27
2.4.3. «Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 28
2.4.4. Tenjtamenco - регулятор транспозиции МДГ4 30
2.4.5. Сравнение ретротранспозиционнои активности двух вариантов МДГ4 33
2.4.6. Распределение двух вариантов МДГ4 в различных линиях Drosophita melanogaster. 37
2.5. Линия Г32 Drosophita melanogaster. 38
3.Материалы и методы. 41
3.1. Штаммы Е. coii, использованные в работе 41
3.2. Пранмеры, использованные в работе 41
3.3. Линии D. melanogaster, использованные в работе 41
3.4. Приготовление компетентных клеток 43
3.4.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК ... 43
3.4.2. Приготовление бактерий для заражения бактериофагом X. 44
3.5. Скрининг бляшек бактериофага X методом гибридизации 44
3.5.1. Заражение Е, colt бактериофагом Я 45
3.5.2. Перенос молекул неупакованной ДНК бактериофага X на нейлоновый фильтр 45
3.5.3. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда 46
3.5.4. Гибридизация 47
3.6. Выделение ДНК 48
3.6.1. Выделение плазмидной ДНК. 48
3.6.2. Выделение ДНК фага X. 51
3.6.3. Выделение геномной ДНК из мух 52
3.7. Рестрикция ДНК 53
3.7.1. Рестрикция плазмидной ДНК 53
3.7.2. Рестрикция ДНК бактериофага X... 54
3.73. Рестрикция геномной ДНК дрозофилы 54
3.8. Лиги рова Н и е 55
3.9. Саузерн-блот гибридизация 56
3.9.1. Перенос ДНК с агарозных гелей на нейлоновые фильтры 56
3.9.2. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда 57
3.9.3. Гибридизация на фильтрах по Са> зерну. 57
3.10. Секвенсирование двуцепочечной ДНК. 57
3.10.1. Заливка полиакриламидного геля для секвенирования 57
3.10.2. Секвенирование двуцепочечной ДНК с помощью набора MBI Fermentas reader DNA sequencing kit. 59
3.10.3. Электрофорез в полиакриламидном геле. 61
4. Результаты. 62
4.1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 D, melanogaster... 62
4.2. Структурный анализ отобранных клонов 65
4.2.1. Выявление полноразмерных копий МДГ4 65
4.2.2. Структурный анализ полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32 67
4.2,2.1. Рестрищионный анализ полноразмерных копий МДГ4. 67
4.2.2.2. Секвенирование функционально валеного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированный из линии Г32 68
4.2.3. Исследование структуры неканонических клонов, имеющих гомологию с МДГ4 69
4.2.3.1. Саузерн-блот анализ отобранных кчоноб... 69
4.2.3.2. Рестрищионный анализ отобранных клонов. ... 73
4.2.3.3. Идентификация клонированного мобильного элемента 75
4.3. Ретротранспозон gtwirt 76
4.3.1. Сравнительный анализ структурной организации ретротранспозонов МДГ4 и gtwin 76
4.3.2. Исследование структуры третьей открытой рамки считывания ретротранспозонов gtwin, клонированных из линии Г32 77
4.3.3. Распределение копий ретротранспозона gtwin в линиях дрозофилы.. 78
5. Обсуждение 83
5.1. Распределение полноразмерных вариантов МДГ4 в геноме Drosophila melanogaster. 83
5.2. Мобильные генетические элементы в составе гетерохроматина: распространение и функции 84
5.3. Распространение ретротра неп озона gtwin в геноме дрозофилы, возможные причины амплификации в линии Г32 87
6. Выводы 90
7. Список литературы 92
Благодарности 102
Приложение 1 104
