Введение
2. Обзор литературы 7
PIC (Preinitiatory complex) 8
РНК-пол имераза II , 8
РНК полимераза II и его CTD 10
Холофермент РНК-полимеразы П 10
Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II 11
TATA бокс 12
ТАТА-связывающие факторы 13
Инициаторный элемент (Inr) 14
DPE (Downstream promoter element) 15
TFIIB распознающий элемент 16
Проксимальный элемент (proximal sequence element - PSE) 16
Другие коровые промоторные элементы 17
Семейство TRF (ТВР-подобных факторов) 39
TRF1 40
TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки 43
TRF2 мыши необходим для сперматогенеза 44
TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы 45
TRF3 46
Ретуляторный ген Drosophila leg-arista-wing complex (lawc) 47
Объект и задачи исследования 49
3. Материалы и методы 50
1. Реактивы 50
2. Программное обеспечение Базы данных 50
3. Работа с ДНК 50
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Вьщеление плазмидной ДНК . Рестрикция, лигнрование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез 50
ПЦР 51
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд 52
5. Работа с РНК 52
Выделение тотальной РНК 52
Очистка polyA+ РНК 53
Получение кДНК, ОТ-ПЦР, 5-, З-RACE 53
Нозерн анализ 53
6. Генетические скрещивания, фенотипический анализ trf2 мутантов 54
7. Работа с белками 55
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков .55
Получение антител и их очистка 55
Белковый гель-электрофорез 56
Иммуноблоттинг 56
Dot-blot 57
Выделение эмбрионального ядерного экстракта 57
Хроматография 57
Получение белковых экстрактов из эмбрионов 57
8. Гибридизация in situ 58
Гибридизация семенников in situ 58
9. Иммуноокрашивание 58
Иммуноокрашивание политенных хромосом 58
Иммуноокрашивание эмбрионов , 59
Иммуноокрашивание яичников и семенников 59
10. Работа с эмбриональными клетками D.melanogaster 59
4.Результаты 60
1. Изучение структуры гена trf2 , , 60
Картирование мутации lawc 60
Исследование влияния мутации lawc на уровень экспрессии гена trfl 60
Клонирование кЩ1К trfi 61
2.Изучение белков, кодируемых геном tr/2 63
3. Иммуноокрашивание хромосом и хроматография 66
Локализация на политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster 66
Хроматографическое исследование 67
3. Анализ гомологов TRF2 у различных видов Drosophila... 69
4. Анализ экспрессии гена trf2 73
Иозерн развития 73
Нозерн тканей 73
Вестерн блот гибридизация тканей 73
Иммуноокрашивание яичников 74
Иммуноокрашивание семенников антителами к TRF2 и ТВР 79
Гибридизация семенников in situ 80
Вестерн блот анализ семенников мутантных мух 80
5. Обсуждение результатов. 83
6. Выводы 89
Благодарности 90
Список литературы. 91
