Введение
1 Введение 6
1.1 Актуальность темы исследования 6
1.2 Цель работы 7
1.3 Задачи исследования 7
1.4 Новизна полученных результатов 7
1.5 Методология и методы диссертационного исследования 8
1.6 Апробация результатов исследования 9
2 Обзор литературы 10
2.1 Общий план строения ядерной оболочки 10
2.2 Белки-ламины - основной компонент ламины 11
2.3 Строение молекул ламинов 12
2.4 Функции доменов ламинов 13
2.5 Фарнезилирование ламинов 15
2.6 Тонкое строение ламины 16
2.7 Поведение ламинов в митозе 19
2.8 Скорость обмена ламинов 20
2.9 Связь ламины и хроматина 21
2.10 Ламины и транскрипция 22
2.10.1 Влияние экспрессии ламинов на общий уровень транскрипции 23
2.10.2 Ламины как транскрипционные факторы 24
2.10.3 Транскрипция и положение внутри ядра 25
2.11 Ламины и репликация 28
2.11.1 Для запуска репликации необходимо образование ламины 29
2.11.2 Ламины как факторы репликации
2.12 Определение положения хроматина внутри ядра 31
2.13 Ламины и репарация 32
2.14 Ламины и апоптоз 32
2.15 Нарушения, вызванные патологическими изменениями в ламинах
2.15.1 Ламинопатии: один ген, широкий спектр заболеваний 33
2.15.2 Ламинопатии, связанные с нарушением механической прочности ядерной оболочки 34
2.15.3 Ламинопатии, связанные с токсичностью незрелых форм ламина
2.15.4 Патологии, связанные с ламином В 37
2.16 Связь ламинов с цитоскелетом 39
2.17 Заключение 41
3 Материалы и методы 43
3.1 Работа с эукариотическими клетками 43
3.1.1 Культивирование клеток 43
3.1.2 Трансфекция эукариотических клеток 43
3.1.3 Получение стабильных линий 44
3.1.4 Репликативное мечение, детекция репликативной метки 45
3.1.5 Синхронизация СНО 45
3.1.6 Получение ядерных почек 46
3.2 Работа с прокариотическими клетками 46
3.2.1 Получение компетентных клеток 46
3.2.2 Трансформация бактерий 47
3.2.3 Выделение ДНК из бактерий 47
3.2.4 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 47
3.3 Cветовая микроскопия: пробоподготовка, получение и анализ изображений 48
3.3.1 Прижизненные наблюдения 48
3.3.2 Высокопроизводительный микроскопический скрининг 49
3.3.3 Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) 50
3.3.4 Широкопольная флуоресцентная микроскопия 51
3.3.5 Деконволюция 51
3.3.6 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 51
3.3.7 Оптическая микроскопия с суперразрешением 52
3.4 Электронная микроскопия 53
3.4.1 Пробоподготовка для корреляционной световой и электронной микроскопии 53
3.4.2 Пробоподготовка для иммуноэлектронная микроскопия 53
3.4.3 Реакция серебряного усиления 54
3.4.4 Обезвоживание и заключение в эпон 54
3.4.5 Получение срезов, получение изображений 55
3.5 Белковый электрофорез методом Вестерн-блот гибридизации 55
3.5.1 Подготовка лизатов клеточной культуры для белкового электрофореза 55
3.5.2 Белковый электрофорез в денатурирующих условиях 56
3.5.3 Окрашивание полиакриламидных гелей 56
3.5.4 Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 56
3.5.5 Окрашивание антителами и проявление 57
3.6 Использованные антитела 57
3.7 Приготовление использованных в работе растворов и смесей
3.7.1 Приготовление формальдегидного фиксатора 57
3.7.2 Приготовление среды для заключения препаратов 58
3.7.3 Приготовление PBS 58
3.7.4 Приготовление буфера Зеренсена 58
4 Результаты 59
4.1 Рост ядерной оболочки происходит равномерно на протяжении интерфазы 59
4.1.1 Статистический анализ роста ядерной оболочки методом высокопроизводительного микроскопического скрининга 59
4.1.2 Прижизненный анализ роста ядра в клеточном цикле 64
4.2 Микродоменная структура ламины сохраняется неизменной на протяжении интерфазы 66
4.2.1 Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с микродоменной структурой 66
4.2.2 Микродомены ламинов образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях 68
4.2.3 Совокупный анализ неоднородности ламины не выявил изменений ее структуры в течение интерфазы 70
4.2.4 Степень полимеризации ламинов остается неизменной в течение интерфазы... 73
4.2.5 Характер распределения ламинов А и В1 в составе ядерной оболочки отличается. 74
4.3 Моделирование роста ламины на свободной ядерной оболочке в интерфазном
ядре 76
4.3.1 Образование ядерных почек не приводит к значительным нарушениям внутриклеточных процессов 76
4.3.2 Образование ядерных почек происходит не во всех клетках 77
4.3.3 В ядерные почки мигрирует хроматин 78
4.3.4 Динамика установления взаимодействие хроматина и ядерной оболочки в почках 79
4.3.5 Динамика образования ламины в ядерной почке 82
4.4 Скорость обмена ламинов на разных стадиях интерфазы 83
4.4.1 Разработка метода оценки скорости обмена ламинов 83
4.4.2 Скорость обмена ламина А выше, чем ламина В1 84
4.4.3 Изменение скорости обмена ламинов в зависимости от стадии интерфазы 85
4.5 Количество ламина В1 в растворимой фракции меняется в течение интерфазы.. 87
4.6 Ламина и репликация периферического гетерохроматина
4.6.1 Скорость обмена ламинов В1 в течение S фазы постоянна 90
4.6.2 Суммарный анализ плотности мечения ламины относительно репликативных фокусов 91
4.6.3 Анализ плотности мечения ламины напротив индивидуальных фокусов репликации 96
4.6.4 Репликация периферического ГХ не требует открепления отЯО 98
4.6.5 Обратимое перемещение HSR во время репликации происходит без открепления локуса от ядерной оболочки
5 Обсуждение результатов 102
6 Заключение 112
7 Выводы 115
8 Список сокращений 116
9 Список цитируемой литературы
