Введение
2. Морфология бактериальной рибосомы, элонгационный цикл, функционально-важные участки рибосомы. 10
3. Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомиых субчастиц Е. coli. 15
3.1. Формирование малой рибосомиой субчастицьт Е. coli. 15
3.2, Участие рибосомных белков в формировании функциональных сайтов
30S рибосомиой субчастицы. 21
3.2.1. Специфическое связывание тРНК в А-сайте 30S субчастицы. 22
3.2.2. Связывание тРНК в Р-сайте. Роль белков S9 и S13. 24
3.2.3. Роль белка S1 в связывании мРНК, 26
3.3. Сборка большой рибосомиой субчастицы Е. coli. 28
3.4, Участие рибосомных белков в формировании функционально-важных
участков 50S субчастицы. 32
3.4.1. Пептидилтрансферазиый центр. 32
3.4.2. ГТФазный центр, роль белков L7/L12 и L11 в трансляции, 34
3.4.3. Ll-BbicTyn50S субчастицы. 35
4. Дополнительные функции рибосомных белков. 36
4.1. Рибосомные белки, регулирующие экспрессию генов. 36
4.2. Внерибосомиые функции рибосомных белков Е. coli. 38
5. Заключение, 39
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
1. Материалы и приборы. 41
1.1 Химические реактивы. 41
1.2 Питательные среды. 41
1.3 Приборы. 42
1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды . 43
2. Методы. 44
2.1. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии. 44
2.1.1. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация плазмидной ДНК. 44
2.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli. 45
2.1.3. Полимеразная цепная реакция. 46
2.1.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции. 47
2.1.5. Клонирование гена белка СТС Bacillus subtiltis и гена N-концевого фрагмента белка TL5 Thermus thermophilus для экспрессии в клетках & coli. 47
2.1.6. Направленный мутагенез N-концевого фрагмента белка TL5 Т. thermophilus. 48
2.1.7. Экспрессия рекомбинантных генов в клетках Е coli. 50
2.1.8. Нокаут хромосомных генов Е. coli с использованием метода «recombineering». 50
2.1.9. Клонирование генов in vivo с использованием «recombineering», 54
2.1.10. Анализ необходимости гена для выживания клеток Е. coli. 57
2.1.11. Общая траисдукция бактериофагом PL 58
2.1.12. Определение времени удвоения клеток Е. coli. 59
2.1.13. р-галактозидазный тест. 60
2.2. Биохимические методы. 61
2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле. 61
2.2.2. Электрофорез РНК в ПААГ в присутствии мочевины и ЭДТА. 62
2.2.3. Электрофорез РНК и РНК-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях. 62
2.2.4. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН. 63
2.2.5. Двумерный электрофорез белков в ПААГ. 64
2.2.6. Выделение белка СТС Bacillus subtilis из клеток суперпродуцентного штамма Е. coli. 65
2.2.7. Выделение N-концевого фрагмента белка TL5 Т. thermophilus и его измененных форм из клеток суперпродуцентного штамма Е. coli. 66
2.2.8. Выделение рибосом из Е. со/г". 67
2.2.9. Анализ рибосом Е. coli центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. 67
2.2.10. Получение безрибосомного экстракта S100 и тотальной ферментной фракции из клеток Е. coll. 68
2.2.11. Трансляция ікши(ІІ) и природных мРНК в бесклеточной системе из Е. coli. 68
2.2.12. Ограниченный гидролиз 5S рРНК РНКазой А. 69
2.2.13. Выделение SSpPHK Е. coli и мечеыие по 5-концу. 70
2.2.14. Определение константы диссоциации комплекса TL5-5S рРНК методом сорбции на натроцеллюлозных фильтрах. 70
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 72
1. Нокаут генов рибосомных белков «платформы» 30S рибосомной субчастицы Escherichia coli. 72
2. Нокаут генов 5S рРНК-связывающих рибосомных белков Е. coli. 81
3. Изучение механизма взаимодействия белков семейства СТС с 5S рРНК. 93
3.1. РНК-связывающие свойства основного стрессового белка СТС Bacillus subtilis. 93
3.2. Поиск аминокислотных остатков, ответственных за узнавание 5S рРНК белками семейства СТС. 97
ВЫВОДЫ 107
БЛАГОДАРНОСТИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
