Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Транскрипционные факторы семейства KNOX и их роль в развитии растений 13
1.1.1. Гены KNOX первого класса (KNOX I) 15
1.1.2. Гены KNOX второго класса (KNOX II) 17
1.1.3. Взаимодействие белков KNOX-BELL 19
1.1.4. Гены KNOX у растений из семейства бобовые .20
1.2. Цитокинины и их роль в развитии растений .22
1.2.1. Биосинтез, катаболизм и инактивация цитокининов .23
1.3. Роль транскрипционных факторов и гормонов в регуляции активности меристемы побега 27
1.3.1. Участие генов KNOX в регуляции биосинтеза цитокинина 29
1.4. Регуляция развития симбиотических клубеньков .32
1.4.1. Молекулярные основы бобово-ризобиальных взаимодействий 33
1.4.1.1. Инфицирование ризобиями тканей корня растения .35
1.4.1.2. Восприятие Nod-фактора .36
1.4.1.3. Сигнальный каскад, активируемый Nod-фактором 37
1.4.2. Системный контроль клубенькообразования (авторегуляция, AON) 40
1.4.3. Роль цитокинина в развитии клубеньков (регуляторные пути, фунционируюшие в коре корня) 46
1.4.3.1. Идентификация ключевых компонентов клубенькообразования, связанных с цитокинином (сигнальный путь, индуцируемый цитокинином) .46
1.4.3.2. Роль цитокинина в развитии инфекционных нитей и инициации примордиев клубеньков .50
1.4.3.3. Цитокинин и авторегуляция клубеньткообразования 51
1.4.4. Роль ауксина в развитии клубеньков .52
1.5. Заключение 54
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Растительный материал 57
2.2. Условия выращивания растений 57
2.3. Штаммы микроорганизмов 57
2.4. Векторы и генетические конструкции 58
2.5. Среды и условия культивирования бактерий 58
2.6. Выделение растительной ДНК 58
2.7. Получение компетентных клеток E. coli 59
2.8. Выделение плазмидной ДНК 59
2.9. Секвенирование ДНК 59
2.10. Выделение тотальной РНК растений 59
2.11. Анализ экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР (ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией) .59
2.12. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени 60
2.13. Получение компетентных клеток A. rhizogenes .61
2.14. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes .61
2.15. Анализ активности репортерного белка бета-глюкоронидазы в трансгенных тканях растений .62
2.16. Получение срезов тканей растений 62
2.17. Создание конструкции для гетерологичной экспрессии KNOX3-CDS и KNOX3-HD в Pichia pastoris, культивирование штаммов-продуцентов, выделение и очистка белка 62
2.18. анализ сдвига электрофоретической подвижности (англ. EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay) 63
2.19. Анализ взаимодействия с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (англ. SPR: surface plasmon resonance) 64
2.20. Обработка растений нитратом .65
2.21. Компьютерные программы и статистические методы , используемые в работе 65
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Анализ экспрессии генов семейства KNOX при клубенькообразовании 67
3.1.1. Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитии клубеньков .67
3.1.1.1. Анализ последовательностей генов MtKNOX в базах данных, подбор праймеров .67
3.1.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитии клубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времени .68
3.1.2. Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 при клубенькообразовании 70
3.1.2.1. создание вектора для локализации экспрессии гена MtKNOX3 (pMtKNOX3:GUS) 70
3.1.2.2. Трансформация полученным вектором растений М. truncatula с помощью A. rhizogenes и анализ активности промоторов гена MtKNOX3 с помощью репортерного белка GUS 72
3.2. Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизм цитокинина, при клубенькообразовании .74
3.2.1. Поиск последовательностей генов, кодирующих IPT M. truncatula, в базах данных, подбор праймеров .75
3.2.2. Анализ экспрессии генов MtIPT на разных стадиях развития клубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времени 77
3.2.3. Поиск последовательностей генов, кодирующих LOG M. truncatula, в базах данных, подбор праймеров .78
3.2.4. Анализ экспрессии генов MtLOG на разных стадиях развитии клубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времени 79
3.3. Изучение роли гена MtKNOX3 с помощью изменения уровня экспрессии этого гена в трансгенных корнях 81
3.3.1. Изучение влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на развитие клубеньков 81
3.3.1.1. Создание векторов, трансформация растений полученными конструкциями с помощью A. rhizogenes .81
3.3.1.2. Оценка влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на клубенькообразование 86
3.3.1.3. Оценка уровня экспрессии симбиоз-индуциркемых генов MtIPT и MtLOG в спонтанных клубеньках (клубенькоподобных структурах) .90
3.3.2. Изучение влияния искусственного подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощью интерференции РНК на развитие клубеньков и экспрессию предполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG) .91
3.3.2.1. Создание векторов, трансформация растений полученными конструкциями с помощью A. rhizogenes 92
3.3.2.2. Оценка влияния подавления гена MtKNOX3 на клубенькообразование и экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм цитокинина .96
3.4. Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторами предполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG) .99
3.4.1. Поиск предполагаемых сайтов мишени в промоторе или интроне генов MtIPT и MtLOG .99
3.4.2. Наработка гомеодомена ТФ MtKNOX3 в гетерологичной системе для последующего анализа его связывания с последовательностями-мишенями (Создание конструкции, трансформация дрожжей P. Pastoris, наработка и очистка белка) 101
3.4.3. Изучение связывания гомеодомена ТФ MtKNOX3 с предполагаемыми сайтами-мишенями 105
3.4.3.1. Изучение связывания гомеодомена MtKNOX3 с последовательностями-мишениями с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 105
3.4.3.2. Изучение связывания гомеодомена MtKNOX3 с последовательностями-мишениями с помощью метода на основе ППР (поверхностный плазмонный резонанс, анг. SPR) с использованием системы ProteON 106
3.5. Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX3 с компонентами системы авторегуляции клубенькообразования (AON): CLV1-подобной киназой MtSUNN и CLE-пептидами 108
3.5.1. Изучение экспрессии генов MtKNOX и MtIPT у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 (в.т.ч локальный анализ экспрессии MtKNOX3) .108
3.5.1.1. Анализ экспрессии генов MtIPT в побеге в ответ на инокуляции у растений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 .109
3.5.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX в побеге в ответ на инокуляции у растений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 .111
3.5.1.3. Анализ экспрессии генов MtIPT и MtKNOX в корнях суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 113
3.5.1.4. Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 115
3.5.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощью интерференции РНК на экспрессию генов CLE, активируемых при клубенькообразовании 117
3.5.2.1. Анализ экспрессии клубенек-специфичных генов CLE (в т.ч. изучение влияния нитрата на экспрессию генов CLE) .117
3.5.2.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 на экспрессию CLE 121
Глава 4. Заключение .123
Выводы 128
Список сокращений 129
Список литературы .130
Благодарности 158
Приложение 159
