Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 18
1.1. Характеристика гена Trithorax-like 18
1.1.1. Структура и экспрессия гена Trithorax-like 18
1.1.2. Регуляция экспрессии гена ТН 20
1.1.3. Структура белка GAGA 22
1.1.3.1. Доменная структура белка GAGA 23
1.1.4. Эволюционная консервативность белка GAGA 26
1.1.5. Взаимодействие изоформ белка GAGA между собой, а
также с другими белками и белковыми комплексами 27
1.1.6. Роль белка GAGAB регуляции экспрессии генов 30
1.1.6.1. Белок GAGA играет важную роль в регуляции экспрессии генов дрозофилы, изменяя структуру хроматина в регуляторных элементах генов 30
1.1.6.2. Белок GAGA влияет на транскрипцию, воздействуя на функционирование инсуляторов 32
1.1.6.3. GAGA может влиять на транскрипцию генов, взаимодействуя с белками, связывающимися с ТАГА боксом 32
1.1.6.4. GAGA может участвовать в элонгации транскрипции генов 33
1.1.6.5. GAGA может участвовать в паузировании РНК полимеразы II 33
1.1.6.6. GAGA может обеспечивать контакт удаленных регуляторных элементов 35
1.1.6.7. Белок GAGA действует как активатор, так и репрессор транскрипции генов 35
1.1.7. Влияние белка GAGAHa деление клеток 38
1.1.8. Белок GAGA участвует в обеспечении дозовой компенсации у самцов дрозофилы 39
1.2. Развитие половой системы Drosophila melanogaster 41
1.2.1. Ранние этапы развития половой системы дрозофилы 41
1.2.2. Развитие половой системы самок дрозофилы
1.2.3. Развитие яйцевой камеры после выхода из гермария 48
1.2.4. Транспорт питающих веществ, нарабатываемый в питающих клетках в ооцит 56
1.2.4.1. Структура актинового цитоскелета питающих клеток во время быстрого транспорта 57
1.2.5. Эволюционная консервативность оогенеза 59
1.3. Развитие половой системы самцов Drosophila melanogaster 60
1.4. Формирование глаза дрозофилы
1.4.1. Структура глаза дрорзофилы 66
1.4.2. Развитие глаза дрозофилы 68
1.4.3. Дифференцировка клеток омматидия 69
1.4.4. Генетический контроль дифференцировки клеток омматидия 72
Глава 2. Материалы и методы 77
2.1. Материалы, использованные в работе 77
2.2. Олигонуклеотиды используемые в работе 78
2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 79
2.4. Анализ жизнеспособности дрозофил 81
2.5. Получение мутаций, затрагивающих 5 -область гена ТН с помощью неправильных эксцизий 81
2.6. Введение трансгенов, экспрессирующих кДНК гена ТН, в геном мутантных мух 82
2.7. Выделение ДНК 82
2.8. Секвенирование ДНК с использованием набора для секвенирования BigDye Terminator Ready Mix 82
2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 2.10. Электрофорез ДНК в агарозном геле 83
2.11. Выделение РНК 84
2.12. Получение 32Р-меченых ДНК-зондов 84
2.13. Гибридизация in situ на гистологических срезах 84
2.14. Нозерн-блот гибридизация 85
2.15. Обработка РНК ДНКазой 1 85
2.16. Обратная транскрипция (ОТ) 86
2.17. Полногеномный анализ экспрессии с использованием микрочипов 86 2.18. ПЦР в «реальном времени» 88
2.19. Вестерн-блот-анализ 88
2.20. Иммунохимическое окрашивание тканей дрозофилы 89
2.21. Окрашивание яичников дрозофилы с помощью фаллоидина 89
2.22. Приготовление препаратов для электронной микроскопии 90
2.23. Приготовление полутонких срезов глаз дрозофилы 90
2.24. Приготовление препаратов хромосом слюнных желез дрозофилы для световой микроскопии 90
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 91
3.1. Изучение экспрессии гена Trithorax-like в различных
органах и тканях в ходе развития Drosophila melanogaster 91
3.2. Анализ 5 -некодирующей области гена ТН 96
3.2.1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих 5 -некодирующую область гена ТН 97
3.2.2. Жизнеспособность мутантов с нарушением структуры 5 -области гена ТН 99
3.2.3. Анализ фертильности мутантов с нарушением структуры 5 -области гена ТН 100
3.2.4. Анализ экспрессии гена ТН у мутантов с нарушенной структурой 5 -области гена 103
3.2.4.1. Экспрессия гена ТН на стадии куколки 103
3.2.4.2. Экспрессия гена ТН в разных тканях дрозофилы
3.2.4.2.1. Экспрессия гена ТНъ яичниках 105
3.2.4.2.2. Экспрессия гена ТН в комплексе мозг-вентральный ганглий и прилегающих имагинальных дисках 107
3.2.5. Анализ мутантов ТН3609 108
3.3. Анализ регуляторного потенциала второго интрона гена ТН Drosophila melanogaster 113
3.3.1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена ТИ 113
3.3.2. Жизнеспособность мутантов с нарушением структуры второго интрона гена ТН 121
3.3.3. Анализ экспрессии гена ТН у мутантов с нарушенной структурой второго интрона гена 122
3.3.4. Анализ молекулярной структуры второго интрона гена ТН 123
3.4. Ген ТН и оогенез Drosophila melanogaster 128
3.4.1. Морфологические нарушения, наблюдаемые в питающих клетках 7 /-мутантов 130
3.4.1.1. Нарушение числа питающих клеток 7 /-мутантов 130
3.4.1.2. Изменение структуры хроматина в питающих клетках 7 /-мутантов 133
3.4.1.3. Нарушения в формировании цитоплазматических актиновых филаментов питающих клеток ТН-мутантов 135
3.4.2. Морфологические нарушения ооцитау 7 /-мутантов 137
3.4.3. Нарушения в функционировании фолликулярных клеток 7 /-мутантов 138
3.4.4. Причины нарушения оогенеза у 7 /-мутантов 142
3.4.4.1. Причины нарушения в структуре ЦАФ у ТН-мутантов 145
3.4.4.2. Причины нарушения в функционировании
соматических клеток яйцевой камеры 7 /-мутантов 148
3.5. Влияние белка GAGA на сперматогенез дрозофилы 154
3.5.1. Развитие половой системы 7 /-мутантов на стадии эмбриогенеза 156
3.5.2. Формирование гонад у личинок самцов дрозофилы в норме и у 7 /-мутантов 161
3.5.3. Сперматогенез на фоне снижения количества белка GAGA 162
3.6. Влияние белка GAGA на формирование глаза дрозофилы 168
3.6.1. Анализ поверхности глаза у 7 /-мутантов 168
3.6.2. Анализ полутонких срезов глаз имаго дрозофилы 170
3.6.3. Анализ глазо-антеннальных имагинальных дисков ТН-мутантов 173
3.6.4. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge 178
3.6.5. Генетическое взаимодействие генов ТНиВагНІ 182
3.6.6. Анализ экспрессии генов lz и Ваг у мутантов TH362/THR85 и THen82/THR85 183
Выводы 190
Список используемой литературы 192
