Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Спинальная мышечная атрофия 13
1.1.1. Общая характеристика и классификация 13
1.1.2. Основы этиопатогенеза
1.1.2.1. Гены SMN1 и SMN2 14
1.1.2.2. Функции белка SMN
1.1.3. Основные модели СМА в системе in vivo 21
1.1.4. Молекулярно-генетическая диагностика СМА 24
1.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека как
основа для создания клеточных моделей спинальной мышечной атрофии 28
1.2.1. Открытие феномена индуцированной плюрипотентности 28
1.2.2. Способы репрограммирования соматических клеток к плюрипотентному состоянию 33
1.2.3. Методы, используемые для оценки плюрипотентностного статуса стволовых клеток человека 36
1.2.4. Направленная дифференцировка ИПСК в моторные нейроны 43
1.2.5. Изучение клеточных моделей СМА 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 53
2.1. Материалы 53
2.1.1. Культуральные среды, сыворотки, антибиотики, добавки 53
2.1.2. Факторы роста, низкомолекулярные активаторы/ингибиторы сигнальных путей 53
2.1.3. Реактивы 54
2.1.4. Ферменты 54
2.1.5. Наборы 54
2.1.6. Растворы и буферы 55
2.2. Методы 55
2.2.1. Методы работы с клеточными культурами 55
2.2.1.1. Состав сред и условия культивирования 55
2.2.1.2. Получение культур клеток
2.2.1.2.1. Получение ИПСК из фибробластов кожи человека 57
2.2.1.2.2. Получение митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши 58
2.2.1.2.3. Направленная дифференцировка ИПСК в моторные
нейроны 59
2.2.1.3. Замораживание клеток 60
2.2.1.4. Размораживание клеток
2.2.2. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы 61
2.2.3. Спонтанная дифференцировка ИПСК in vitro 61
2.2.4. Спонтанная дифференцировка ИПСК in vivo 62
2.2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание 63
2.2.6. Проточная цитофлуориметрия 65
2.2.7. Анализ кариотипа 65
2.2.8. Выделение РНК 67
2.2.9. Синтез кДНК методом обратной транскрипции 67
2.2.10. Полимеразная цепная реакция 68
2.2.11. ПЦР в реальном времени для определения количества копий эписом на клетку 71
2.2.12. Мультиплексная ПЦР в реальном времени для детекции количества копий гена SMN2 72
2.2.13. Электрофорез ДНК в агарозном геле 73
2.2.14. Рестрикционный анализ 73
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 75
3.1. Определение оптимальной концентрации эписомной ДНК, используемой для репрограммирования 75
3.2. Репрограммирование пациент-специфичных фибробластов 76
3.3. Профиль экспрессии генов, участвующих в поддержании плюрипотентности 79
3.4. Спонтанная дифференцировка ИПСК в эмбриоидных тельцах 81
3.5. Тератомный тест 84
3.6. Кариотипирование полученных линий ИПСК 87
3.7. Характеристика генотипа пациент-специфичных ИПСК 88
3.8. Анализ копийности эписом в полученных линиях ИПСК 91
3.9. Направленная дифференцировка ИПСК в моторные нейроны 94
Заключение 99
Выводы 101
Список литературы
