Введение
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1. Вирус гепатита В, его место в группе HBV-подобных вирусов (гепаднавирусов) .10
2. Структура HBV II
2.1. Вирусные антигены II
2.2. Структура геномной ДНК HBV 13
3. Генноинженерный этап в изучении HBV 15
3.1. Клонирование, вирусной ДНК в бактериальных векторах 15
3.2. Первичная структура генома HBV 17
4. Экспрессия гена HBsAg в бактериальных клетках . 20
4.1. Структура HBsAg 20
4.2. Иммунологические свойства HBsAg 24
4.3. Синтез HBsAg в бактериальных клетках . 26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 32
1. Бактерии, плазмидные и фаговые вектора 33
2. Ферменты 33
3. Электрофорез ДНК 34
4. Препаративное выделение плазмид 34
5. Отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК . 36
6. Скрининг рекомбинантных плазмид 36
7. Секвенирование ДНК 37
8. Клонирование ДНК HBV 38
8.1. Выделение частиц Дейна 38
8.2. Получение ДНК HBV 38
8.3. Клонирование ДНК HBV и отбор рекомбинантных клонов 38
9. Конструирование рекомбинантных плазмид 40
9.1. Рестрикция ДНК и выделение фрагментов 40
9.2. Выравнивание "липких" концов ДНК 41
9.3. Лигирование 42
9.4. Коннекторный способ конструирования рекомбинантных плазмид ^3
10. Определение бактериальных HBsAg-полипептидов методом конкурентной иммунопреципитации 43
11. Определение молекулярной массы бактериальных HBsAg-полипептидов иммунопреципитацией белка,
меченого in vivo s-метионином 45
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47
1. Клонирование генома HBV 48
2. Конструирование плазмид для экспрессии гена HBsAg в E.coli 51
2.1. Конструирование вектора рТК3230 56
2.2. Конструирование плазмиды рСМ8, несущей гибридный ген cat-HBsAg 60
2.3. Конструирование плазмиды рСМ217, несущей 26 63
2.4. Подстановка гибридных генов оперона E. 66
2.5. Конструирование плазмиды рКМЮ, несущей гибридный ген kan-HBsAg226 72
2.6. Подстановка гибридного гена kan-HBsAg226 под промотор триптофанового оперона
E.coli 75
2.7. Конструирование плазмиды pLH12, несущей гибридный ген Ыа-HBsAg204 75
2.8. Конструирование плазмид для прямой экспрессии гена HBsAg 78
3. Иммунологическое определение синтеза HBsAg В E.coli 80
3.1. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli методом конкурентной иммунопреципитации 80
3.2. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli иммунопреципитацией
меченого белка 87
3.3. Эффективность синтеза химерных белков, содержащих HBsAg 90
3.4. Эффективность прямой экспрессии гена HBsAg в E.coli 98
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
