Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Воздействие нефти и нефтепродуктов на свойства почвы и живые организмы
1.1.1. Изменение основных свойств почвы при ее загрязнении нефтью и ее
производными 13
1.1.2. Действие углеводородов нефти на почвенную микробиоту 17
1.1.3. Изменение ферментативной активности почвы в результате попадания в нее нефти 20
1.1.4. Влияние нефтезагрязнения на растения, животных и человека
1.2. Естественная биодеградация нефти в почве 27
1.3. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов 32
1.4. Методы биоремедиации территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами 34
1.4.1. Стимуляция аборигенной микрофлоры.. 36
1.4.2. Интродукция углеводородокисляющих микроорганизмов.. 40
1.4.3. Биопрепараты для очистки нефтезагрязненных почв 41
1.5. Приемы стимуляции биодеградации нефти 49
1.5.1. Применение диазотрофных микроорганизмов 49
1.5.2. Образование биосурфактантов углеводородокисляющими микроорганизмами 53
1.6. Современные методы идентификации микроорганизмов 61
1.6.1. Секвенирование и филогенетический анализ 61
1.6.2. Анализ содержания жирных кислот в клеточной стенке микроорганизмов 67
1.6.3. МАЛДИ-масс-спектрометрия клеточных белков микроорганизмов 69
2. Объекты и методы исследования 73
2.1. Объекты исследований 73
2.2. Среды для культивирования микроорганизмов 73
2.3. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов 74
2.4. Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных культур 75
2.5. Идентификация штаммов микроорганизмов молекулярно-генетическими методами
2.5.1. Выделение ДНК 75
2.5.2. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК 75
2.5.3. Определение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего субъединицу ДНК-гиразы 76
2.5.4. Построение дендрограмм филогенетического сходства изучаемых штаммов микроорганизмов 78
2.6. Определение видовой принадлежности микроорганизмов консорциума масс спектрометрическими методами 78
2.6.1. Определение качественного и количественного состава жирных кислот клеточных стенок микроорганизмов консорциума 78
2.6.2. МАЛДИ-ВП-масс-спектрометрия клеточных белков штаммов, входящих в состав консорциума
2.7. Исследование окислительной активности консорциума и входящих в него микроорганизмов 80
2.8. Выявление нитрогеназной активности штамма Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 80
2.9. Исследование поверхностно-активных свойств штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 2.9.1. Поверхностное натяжение 82
2.9.2. Индекс эмульгирования 82
2.10. Выявление фитотоксичности консорциума и входящих в него штаммов 83
2.11. Определение эффективности процесса биодеструкции нефти в полевых экспериментах 83
2.11.1. Измерение массовой концентрации нефтепродуктов в почве 84
2.11.2. Определение численности основных групп микроорганизмов 84
2.12. Определение фитотоксичности отбеливающей глины 84
2.13. Полевой эксперимент по биорекультивации нефтезагрязненной
отбеливающей глины 85
2.14. Статистическая обработка результатов 86
3. Результаты и их обсуждение 87
3.1. Таксономические исследования микроорганизмов, составляющих консорциум
3.1.1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства
микроорганизмов консорциума 87
3.1.2. Нуклеотидные последовательности гена 16S pPHK и филогенетическое положение штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 92
3.1.3. Нуклеотидные последовательности гена gyrB и филогенетические древа штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 97
3.1.4. Профиль жирных кислот клеточных стенок микроорганизмов, составляющих консорциум 100
3.1.5. МАЛДИ-ВП-масс-спектрометрия клеточных белков 109
3.2. Свойства микроорганизмов, позволяющие использовать образуемый ими консорциум в экологической биотехнологии (в очистке почвы от нефтезагрязнения) 112
3.2.1. Окислительная активность консорциума и входящих в него микроорганизмов 112
3.2.2. Нитрогеназная активность штамма Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2
114
3.2.3. Потенциальная нитрогеназная активность почвы, инокулированной микроорганизмами Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 117
3.2.4. Поверхностно-активные свойства штамма Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 119
3.2.4.1. Поверхностное натяжение 119
3.2.4.2. Индекс эмульгирования 119
3.2.5. Фитотоксичность штаммов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 120
3.3. Полевые испытания биотехнологии рекультивации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с помощью консорциума микроорганизмов 123
3.3.1. Динамика содержания остаточных нефтепродуктов в отработанной отбеливающей глине в ходе эксперимента 124
3.3.2. Динамика численности основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов 127
3.3.3. Влияние интродукции микроорганизмов на фитотоксичность отработанной отбеливающей глины 132
3.3.4 Производство опытных партий биопрепарата «Ленойл», СХП 134
Заключение 141
Выводы 143
Список использованной литературы
