ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................... 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 18
1.1. Типы программируемой клеточной гибели......................................................... 18
1.2. Апоптоз.................................................................................................................... 19
1.3. Белки семейства Bcl-2............................................................................................ 23
1.3.1. Проапоптотические эффекторные белки.......................................................... 24
1.3.2. Антиапоптотические белки................................................................................ 25
1.3.3. Проапоптотические BH3-only белки................................................................. 26
1.3.4. Взаимная регуляции белков семейства Bcl-2................................................... 27
1.4. Белки семейства Bcl-2 в качестве мишеней противораковой терапии............. 28
1.4.1. Спектр действия ВН3-миметиков...................................................................... 28
1.4.2. Подавление белка Bcl-2...................................................................................... 32
1.4.3. Трудности с ингибированием Bcl-xL................................................................ 33
1.4.4. Таргетирование белков Bcl-w и Bfl-1 ............................................................... 34
1.5. Mcl-1 – особенный белок семейства Bcl-2 .......................................................... 35
1.5.1. Непрямые ингибиторы Mcl-1 (транскрипционный уровень)......................... 38
1.5.2. Непрямые ингибиторы Mcl-1 (трансляционный уровень) ............................. 39
1.5.3. Непрямые ингибиторы Mcl-1 (посттрансляционный уровень)...................... 40
1.5.4. Создание прямых ингибиторов Mcl-1............................................................... 41
1.6. Перспективные ингибиторы Mcl-1 и рациональные комбинации с их участием
......................................................................................................................................... 48
3
1.7. Прогностические маркеры чувствительности и устойчивости к антагонистам
Mcl-1 ............................................................................................................................... 52
1.8. Белок-белковые взаимодействия р53 и MDM2 как мишень противоопухолевой
терапии ........................................................................................................................... 54
1.8.1. Белок р53: строение и функции «стража генома» ........................................... 55
1.8.2. MDM2: строение и функции регулятора р53 ................................................... 56
1.9. Стратегии таргетирования р53 в зависимости от его статуса ........................... 58
1.9.1. Ингибирование MDM2: активация р53 дикого типа в раковых клетках ...... 59
1.9.2. Активация мутантного р53 в раковых клетках ................................................ 61
1.9.3. Рациональные комбинации с участием ингибиторов MDM2 ........................ 63
1.9.4. Устойчивость опухолевых клеток к ингибированию MDM2......................... 66
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 68
2.1. Материалы............................................................................................................... 68
2.1.1. Буферные и рабочие растворы........................................................................... 68
2.1.2. Реактивы............................................................................................................... 69
2.1.3. Антитела............................................................................................................... 70
2.1.4. Клеточные культуры........................................................................................... 70
2.1.5. Обработка клеток ................................................................................................ 70
2.1.6. Снижение уровня белка за счет РНК-интерференции .................................... 71
2.2. Методы.................................................................................................................... 72
2.2.1. Культивирование клеток .................................................................................... 72
2.2.2. Экспериментальные процедуры ........................................................................ 72
2.2.3. Трансфекция клеток............................................................................................ 72
2.2.4. Вестерн-блот анализ ........................................................................................... 73
4
2.2.5. Проточная цитофлуориметрия........................................................................... 74
2.2.6. ПЦР в реальном времени.................................................................................... 75
2.2.7. Оценка метаболизма клеток............................................................................... 77
2.2.8. Получение нокаутных клеток методом CRISPR/Cas9 .................................... 77
2.2.9. Оценка жизнеспособности клеток (MTS-тест) ................................................ 78
2.2.10. Тест на клоногенную активность .................................................................... 79
2.2.11. Секвенирование нового поколения (NGS) ..................................................... 79
2.2.12. Анализ данных TCGA....................................................................................... 79
2.2.13. Исследование клинических образцов ............................................................. 80
2.2.14. Биоинформатический анализ аминокислотных замен .................................. 81
2.2.15. Моделирование опухоли (ксенографта) у мышей ......................................... 81
2.2.16. Обработка данных............................................................................................. 82
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................. 83
3.1. Сравнительный анализ проапоптотической активности антагонистов Mcl-1
S63845 и A1210477........................................................................................................ 83
3.2. Оценка роли проапоптотических белков семейства Bcl-2 в различной
эффективности действия антагонистов Mcl-1 S63845 и A1210477 ......................... 85
3.3. Изучение механизмов устойчивости опухолевых клеток к действию
антагониста Mcl-1 S63845 ............................................................................................ 94
3.4. Оценка эффективности применения антагонистов Bcl-2 и Bcl-xL для
преодоления устойчивости опухолевых клеток к ингибированию Mcl-1 ............ 104
3.5. Оценка значимости белков семейства Bcl-2 в качестве потенциальных
прогностических маркеров аденокарциномы легкого ............................................ 110
5
3.6. Оценка эффективности совместного использования антагонистов Mcl-1 и
ингибиторов MDM2 .................................................................................................... 114
3.7. Изучение механизмов устойчивости опухолевых клеток к действию
ингибитора MDM2 RG7388........................................................................................ 120
3.8. Обнаружение мутаций в гене TP53 в опухолевых клетках с повышенной
устойчивостью к Идасанутлину и их биоинформатический анализ ..................... 126
3.9. Оценка эффективности применения антагониста Mcl-1 S63845 и стандартных
химиопрепаратов (Цисплатина и Доксорубицина) для преодоления устойчивости
опухолевых клеток к действию RG7388................................................................... 129
3.10. Оценка эффективности применения Доксорубицина для преодоления
устойчивости клеток SH-SY5Y к RG7388 в in vivo модели.................................... 135
3.11. Оценка биологической активности новых производных имидазолина как
новых антагонистов MDM2 ....................................................................................... 136
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................ 143
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................... 149
ВЫВОДЫ..................................................................................................................... 151
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................. 152
