Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1. Идиопатическая рестриктивная кардиомиопатия и спектр ее генетических причин 19
1.2. Кардиомиопатии и нейромышечные заболевания 27
1.3. Особенности течения сердечной недостаточности и прогноз для пациентов с РКМП 34
1.4. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями в гене десмина (DES) 41
1.5. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями в гене ламина А/С (LMNA) 47
1.6. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями в гене сердечного тропонина I (TNNI3) 51
1.7. Роль генетических детерминант в развитии рестриктивного фенотипа и диастолической дисфункции 56
1.8. Перспективы дальнейших научных исследований 60
Глава 2. Материалы и методы 63
2.1. Формирование группы пациентов с идиопатической рестриктивной кардиомиопатией (РКМП) 63
2.2. Формирование группы пациентов с ХСН с целью изучения ассоциации полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функционирования саркомера, с развитием рестриктивного фенотипа 64
2.3. Секвенирование нового поколения 64
2.4. Создание генетических конструкций, несущих мутации гена десмина, для последующей генетической модификации мышечных клеток 65
2.5. Клонирование гена десмина с использованием конструкции на основе лентивирусного вектора 69
2.6. Мутагенез на основе плазмиды с геном десмина 72
2.7. Продукция лентивирусных конструкций, содержащих ген десмина 74
2.8. Получение индуцированных плюрипотентных клеток (иПСК) и их дифференцировка в кардиогенном направлении 75
2.9. Получение первичной культуры мышечных клеток мыши 76
2.10. Культивирование клеток линии С2С12 и миогенная дифференцировка сателлитных клеток и клеток линии С2С12 77
2.11. Трансдукция первичных миофибрилл мыши и клеток линии С2С12 лентивирусными конструкциями 78
2.12. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 79
2.13. ПЦР в реальном времени для определения экспрессии миогенных маркеров 80
2.14. Оценка внутримитохондриального уровня кальция 81
2.14.1. Применение флюоресцентных красителей и стимуляция митохондриального захвата кальция 81
2.14.2. Конфокальная лазерная микроскопия 81
2.15. Исследование функции клеточного дыхания в культуре клеток с использованием прибора «Sea horse» 82
2.16. Исследование функции потенциалзависимого натриевого канала (Nav1.5) с помощью методики локальнй фиксации мембранного потенциала 83
2.17. Создание генетических конструкций, несущих мутации гена LMNA, для последующей модификации мезенхимных стволовых клеток 84
2.18. Культивирование ММСК и их дифференцировка 85
2.19. Подсчет эффективности дифференцировки 85
2.20. Определение колониеобразующей способности ММСК методом предельных разведений 86
2.21. Анализ экспрессии остеогенных и адипогенных маркеров 86
2.22. Множественный анализ экспрессии генов 87
2.23. Вестерн-блоттинг с применением антител к ламину А/С и оценка общей активности гистоновых деацетилаз 88
2.24. Конструирование вектора и мутагенез мутантных форм гена TNNI3 89
2.25. Выделение белка для исследований in vitro 90
2.26. Коседиментация 91
2.27. Поверхностный плазмонный резонанс 92
2.28. Оценка активности актин-миозиновой-S1 АТФ-азы в восстановленном комплексе и силы сокращения изолированных миофибрилл 93
2.29. Определение аллелей и генотипов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени 94
2.30. Статистическая обработка данных 94
2.30.1. Статистическая обработка данных ПЦР в реальном времени 94
2.30.2. Статистическая обработка данных генотипирования и сравнение частот единичных нуклеотидных полиморфизмов 95
2.30.3. Статистическая обработка данных расчета риска исхода ХСН с применением расчетных шкал 96
Глава 3. Клиническая характеристика пациентов с идиопатической рестриктивной кардиомиопатией 97
3.1. Описание исследуемой когорты пациентов 97
3.2. Анализ кривых выживаемости пациентов с РКМП 106
3.3. Анализ возможности использования шкал прогноза ХСН в когорте пациентов с идиопатической РКМП 110
Глава 4. Генетический спектр идиопатической рестриктивной кардиомиопатии 123
4.1. Качество проведенного секвенирования, глубина покрытия и классификация новых и ранее описанных генетических вариантов 123
4.2. Анализ генетических вариантов в соответствии с классификацией ACMG 124
4.3. Моделирование основных белковых взаимодействий и сигнальных связей, ассоциированных с РКМП 140
4.4. Анализ влияния патогенных и вероятно-патогенных вариантов в группе пациентов с РКМП на клиническое течение заболевания 142
Глава 5. Исследование генетической этиологии РКМП в сочетании с признаками поражения нейромышечной системы 146
5.1. РКМП, ассоциированная с мутацией в гене DES 149
5.2. РКМП, ассоциированная с мутацией в гене BAG3 153
5.3. РКМП, ассоциированные с мутациями в гене FLNC 156
Глава 6. Разработка оптимальной схемы генетической диагностики у пациентов с идиопатической РКМП 164
Глава 7. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена десмина DES 169
7.1. Оценка влияния мутантных форм гена десмина на изменение концентрации митохондриального Са2+ в первичной культуре мышечных клеток 169
7.2. Эффект мутаций гена десмина на внутримитохондриальный захват кальция под воздействием электрического тока 170
7.3. Влияние мутаций гена десмина на внутримитохондриальный захват кальция вследствие активации рианодинового рецептора 172
7.4. Эффект мутаций гена десмина на уровень цитоплазматического кальция 173
7.5. Оценка методом «Sea horse» функции клеточного дыхания в культуре миотрубок после трансдукции нормальными и мутантными формами гена десмина 175
7.6. Оценка функции потенциалзависимых натриевых каналов (Nav1.5) в кардиомиоцитах, несущих c.735+1G A мутацию в гене DES 178
Глава 8. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена LMNA 180
8.1. Характеристика мезенхимных стволовых клеток и уровень экспрессии LMNA после лентивирусной трансдукции 180
8.2. Влияние мутации гена ламина на колониеобразующую способность ММСК 182
8.3. Влияние мутаций гена ламина на адипогенную и остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток 183
8.4. Влияние мутаций гена ламина на экспрессию маркеров адипогенной дифференцировки ММСК 184
8.5. Влияние мутаций гена ламина на экспрессию маркеров остеогенной дифференцировки ММСК 185
8.6. Влияние мутации LMNA на экспрессионный профиль при дифференцировке ММСК 187
8.7. Оценка влияния мутаций гена LMNA на дифференцировку сателлитных мышечных клеток в миогенном направлении и формирование миотрубок 198
8.8. Влияние мутаций LMNA на экспрессию маркеров миогенной дифференцировки 202
8.9. Эффект мутаций LMNA на активность гистондеацетилазы 204
Глава 9. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена тропонина I (TNNI3) 206
9.1. Клиническая картина РКМП на фоне мутаций в гене TNNI3 206
9.2. Исследование взаимодействия мутантных форм тропонина I с белками тонких филаментов методом коседиментации и плазмонного резонанса 212
9.3. Оценка активности актин-миозиновой-S1 АТФ-азы 214
9.4. Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функционирования саркомера, с развитием рестриктивного фенотипа у пациентов с ХСН 217
Глава 10. Обсуждение 232
10.1. Особенности клинического течения и информативность шкал расчета риска ХСН при идиопатической РКМП в различных возрастных группах 232
10.2. Генетический спектр идиопатической рестриктивной кардиомиопатии 238
10.3. Исследование генетической этиологии РКМП, протекающей в сочетании с поражением нейромышечной системы 244
10.4. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с патологическими вариантами в гене DES 254
10.5. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с патологическими вариантами в гене LMNA 259
10.6. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных с патологическими вариантами в гене TNNI3 265
10.7. Роль генетических детерминант в развитии рестриктивного фенотипа и диастолической дисфункции 269
Выводы 274
Практические рекомендации 276
Список условных сокращений 278
Список литературы 282
