Введение
Литературный обзор 9
1. Искусственные биокатализаторы 9
1.1. Инженерия биокатализаторов 9
1.2. Целенаправленное изменение биокатализаторов 12
2. Искусственные биокатализаторы на основе антител 14
2.1. Каталитические антитела, получаемые иммунизацией аналогами переходных состояний 15
2.2. Использование химической модификаций или сайт-направленного мутагенеза для введения каталитических остатков 20
2.3. Создание каталитических антител для энергетически невыгодных превращений 21
2.4. Антиидиотипические антитела 22
2.5. Получение абзимов путем реакционной иммунизации 24
2.6. Абзимы, содержащие кофакторы 25
2.7. Границы области применения индуцированных абзимов 26
3. Методы направленной эволюции биокатализаторов 27
3.1. Методы высокоэффективного скрининга ферментов, используя клеточные или фаг-дисплейные библиотеки 28
Компартментализация in vitro 31
Компартментализация in vitro в двойных эмульсиях 32
Микрофлюидная компартментализация 34
3.2. Рациональный дизайн, как средство улучшения каталитической эффективности 35
Рациональный дизайн на основе экспериментальных данных 35
Рациональный дизайн на основе компьютерных методов 38
3.3. Направленное улучшение ферментов 39
Создание ферментов de novo 39
Направленное улучшение функциональных свойств антител 43
4. Биологические антидоты для терапии отравлений фосфорорганическими токсинами 44
4.1. Концепция биологического антидота 44
4.2. Кандидаты на роль стехиометрического антидота 45
Ацетилхолинэстераза 45
Параоксоназа 46
Антитела к ФОТ 47
Бутирилхолинэстераза 48
5. Биотехнологическое получение рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека 48
5.1. Системы экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека 49
5.2. Фармакодинамические характеристики рекомбинантной БУХЭ 51
Материалы и методы 55
Химические реактивы и сопутствующие материалы 55
Методы работы с нуклеиновыми кислотами 58 Методы работы с бактериями E. coli 68
Методы работы с дрожжами Pichia рastoris 69
Методы работы с клетками линии CHO-K1, NSO и FreeStyle 293-F 71
Методы работы с белками 74
Методы работы с животными 85
Микрофлюидная платформа для ультравысокопроизводительного скрининга биокаталитической и антимикробной активности 88
Расчетные методы. 91
Результаты и обсуждение. 94
1. Разработка технологий получения биокатализаторов на основе антител 94
1.1. Получение каталитических и нейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину вич-1 gp120. 94
1.2. Разработка технологии получения «реактибоди» - антител, предрасположенных к ковалентному катализу 104
1.3. Разработка технологии квантово-механических/молекулярно-механических расчетов для искусственного «созревания» антител. 123
2. Разработка микрофлюидной технологии высокопроизводительного скрининга
биокаталитической активности в каплях двойной эмульсии. 142
2.1. Скрининг биокаталитической активности в каплях микрофлюидной двойной эмульсии 147
2.2. Отбор мутантов бухэ, устойчивых к действию ФОТ 156
3. Разработка технологии получения биокатализаторов пролонгированного действия. 160
3.1. Оптимизация фармакодинамических параметров рчбухэ химическим полисиалированием in vitro 165
3.2. Улучшение фармакокинетических характеристик рчбухэ за счет ее продукции исключительно в виде тетрамера 172
Заключение 182
Выводы. 184
Список литературы. 185
