Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Болезнь Альцгйемера. 15
1.2. Гены, связанные с болезнью Альцгеймера. 19
1.2.1. Белок предшественник амилоида (APP). 20
1.2.2. Пресенилины (PS) и гамма-секретаза. 22
1.2.3. Другие гены, связанные с болезнью Альцгеймера . 27
1.3. Модели болезни Альцгеймера in vivo. 32
1.4. Амилоидная гипотеза развития болезни Альцгеймера. 38
1.5. Наследственная болезнь Альцгеймера и спорадическая болезнь Альцгеймера 43
1.6. Терапия болезни Альцгеймера. 44
1.7. Кальциевая гипотеза патологии болезни Альцгеймера. 48
1.8. Депо-управляемые кальциевые каналы. 51
1.9. Нарушения депо-управляемого входа в патологии заболеваний ЦНС. 61
1.10. Ингибиторы депо-управляемого кальциевого входа 65
1.10.1. Лантаноиды. 65
1.10.2. Соединения имидазола 66
1.10.3. Соединения дифенил бората. 66
1.10.4. Соединения пиразола: BTP 68
1.10.5. Соединения пиразола: Pyr. 69
1.10.6. Соедненя пиразола: GSK. 69
1.10.7. Synta 66. 70
1.10.8. ML-9. 71
1.10.9. Диэтилстилбестрол. 71
1.10.10. Карбоксиамидотриазол. 71
1.10.11. RO2959. 72
1.10.12. Линолевая килота 72
1.10.13. Производные 1-фенил-3-(1-фенилэтил)мочевины. 73
1.10.14. Ингибиторы компании CalciMedica. 74
1.10.15. EVP4593. 75
2. Материалы и методы 76
2.1. Материалы. 76
2.2. Клетки и трансфекция. 76
2.3. Мыши. 77
2.4. Получение первичной культуры нейронов гиппокампа. 78
2.5. Получение ленти-вируса и инфицирование нейронов . 78
2.6. Исследование передвижения внутриклеточных белков. 81
2.7. Измерение внутриклеточной динамики кальциевых концентраций. 81
2.8. Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp). 82
2.9. Получение лизатов клеток. 84
2.10. Электрофорез белков и иммуноблоттинг. 84
2.11. Ко-иммунопреципетация. 85
2.12. Клонирование последовательности человеческого гена белка PS1 в вектор pUAST. 86
2.13. Создание трансгенных линий дрозофил. 88
2.14. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе. 89
2.15. Фенотипический анализ экспрессии генов mini-white в трансгенных линиях 90
2.16. Генетические скрещивания. 91
2.17. Условия содержания дрозофил. 93
2.18. Регистрация поведения ухаживания. 93
2.19. Кормление дрозофил питательной смесью с 2-APB. 95
2.20. Статистический анализ. 95
3. Результаты. 96
3.1. Фармакологическое ингибирование эндопротеолиза PS1 влияет на депо-управляемый вход кальция в клетках Neuro2a. 98
3.2. Увеличение уровня полноразмерного белка PS1 при экспрессии неактивного PS1 D257A в клетках мышиных фибробластов MEF с двойным нокаутом генов белков PS1 и PS2 усиливает депо-управляемый вход кальция. 100
3.3. Подавление эндопротеолиза PS1 вызывает усиление активации депо-управляемых кальциевых каналов клетках Neuro2a. 101
3.4. Увеличение отношения полноразмерного PS1 к его терминальному фрагменту увеличивает ISOC в клетках Neuro2a. 106
3.5. Гиперактивация депо-управляемых кальциевых каналов в клетках Neuro2a, вызванная накоплением полноразмерного PS1, не является следствием изменений уровней экспрессии основных белков, определяющих депо-управляемый вход кальция 108
3.6. Пониженный уровень эндопротеолиза PS1 усиливает активацию депо-управляемых каналов в нейронах гиппокампа мыши. 111
3.7. Создание клеточных моделей наследственной БА. 112
3.8. Каналы, образованные белками TRPC1 и Orai1, формируют депо-управляемые кальциевые каналы в нейронах гиппокампа мыши. 114
3.10. Экспрессия PS1 E9 увеличивает амплитуду ISOC в нейронах гиппокампа мыши 116
3.11. Экспрессия PS1 E9 увеличивает амплитуду ISOC и усиливает перемещение сенсоров STIM1 к плазматической мембране в клетках Neuro2a. 119
3.13. Понижение экспрессии STIM1 восстанавливает амплитуду ISOC до контрольных значений в нейронах гиппокампа мыши, экспрессирующих PS1 E9. 124
3.13. Трансгенные Drosophila melanogaster, экспрессирующие мутантный ген PS1 E9 в холинергических нейронах, демонстрирует зависимую от возраста потерю кратковременной памяти . 127
3.14. Ингибитор депо-управляемых кальциевых каналов 2-APB предотвращает потерю кратковременной памяти у трансгенных Drosophila melanogaster 130
3.15. Активность депо-управляемых каналов, образованных субъединицами Orai, может быть связана с чувствительностью нейронов к окислительному стрессу. 132
4. Обсуждение 135
4.1. Изменения в активности каналов при повышении уровня неразрезанного белка PS1 связаны с уровнем его эндопротеолиза, но не связаны с активностью -секретазы и с уровнем A. 135
4.2. Изменения в активности депо-управляемых каналов может быть связано с патологией наследственной БА. 136
4.3. Сенсор STIM1 является ключевым переносчиком патологического сигнала к депо-управляемым каналам и вызывает их гиперактивацию. 137
4.4. Трасгенные Drosophila melanogaster с экспрессией мутантного гена человека PS1 E9 в холинэргической нервной системе демонсрируют потерю кратковременной памяти. 139
4.5. Производные 2-APB могут использованы для разработки новых потенциальных лекарственных препаратов для лечения нейродегеннерации при НБА. 140
Заключение 141
Выводы 142
Список литературы. 143
