Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Внеклеточные везикулы 16
1.1.1 Внеклеточные везикулы клеток млекопитающих - экзосомы и микровезикулы 17
1.1.2 Молекулярный механизм формирования микровезикул 20
1.1.3 Теория паракринной стимуляции регенерации стволовыми клетками и
участие внеклеточных везикул в регенерации и ангиогенезе 25
1.1.4 Концепция бесклеточной терапии на основе внеклеточных везикул 28
1.1.5 Применение внеклеточных везикул для диагностики и терапии
заболеваний 30
1.1.6 Ограничения терапевтического применения внеклеточных везикул 32
1.2 Химическое соединение - цитохалазин В 34
1.2.1 История открытия и структура цитохалазина B 34
1.2.2 Механизм действия цитохалазина В 35
1.2.3 Применение цитохалазина В 38
1.2.4 Получение мембранных везикул с помощью цитохалазина В 41
1.3 Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1 Методы работы с мембранными везикулами клеток человека 46
2.2.1 Получение мембранных везикул от клеток человека, обработанных цитохалазином В 46
2.2.2 Приготовление мембранных везикул для анализа методом динамического рассеяния света 46
2.2.3 Приготовление мембранных везикул для анализа методом полимеразной цепной реакции 47
2.2.4 Приготовление мембранных везикул и проведение трансмиссионной электронной микроскопии 47
2.2.5 Приготовление мембранных везикул и проведение сканирующей электронной микроскопии 48
2.2.6 Окрашивание мембранных везикул Phalloidin, специфичным к актину 49
2.2.7. Детекция процесса синтеза белка 49
2.2.8. Подготовка мембранных везикул для исследования стабильности при разных условиях хранения 50
2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами 51
2.2.1 Выделение тотальной ДНК 51
2.2.2 Выделение плазмидной ДНК 51
2.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 52
2.2.4 Электрофорез в агарозном геле 54
2.3 Методы работы с белками 54
2.3.1 Выделение тотального белка 54
2.3.2 Измерение концентрации белка методом бицинхониновой кислоты 55
2.3.3 Иммуноблоттинг 56
2.3.4 Мультиплексный анализ 57
2.4. Методы работы с прокариотическими клетками 58
2.4.1 Культивирование бактериальных клеток 58
2.4.2 Трансформация бактериальных клеток 58
2.4.3 Криоконсервация бактериальных клеток 59
2.5 Методы работы с эукариотическими клетками 59
2.5.1 Культуры клеток человека, культивирование клеточных культур 59
2.5.2 Пассирование клеточных культур 61
2.5.3 Криоконсервация клеточных культур 62
2.5.4 Исследование размера клеточных компонентов методом проточной
цитофлуориметрии с использованием калибровочных частиц 62
2.5.5 Трансфекция культуры клеток человека 63
2.5.6 Окрашивание цитоскелета клеток человека 63
2.5.7 Иммуноокрашивание клеток человека 64
2.5.8 Окрашивание мембранными красителями клеток человека 64
2.5.9 Окрашивание клеток человека красителем CFDA SE 65
2.6 Оценка процесса слияния и переноса содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента in vitro 66
2.6.1 Нанесение мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В, на клетки-реципиенты 66
2.6.2 Оценка количества клеток-реципиентов, обладающих флуоресценцией, и средней интенсивности флуоресценции методом проточной цитофлуориметрии 67
2.7 Оценка проангиогеного потенциала in vitro и in vivo 68
2.7.1 Формирование капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro 68
2.7.2 Подкожная инъекция мембранных везикул и клеток человека в матриксе Matrigel лабораторным животным Rattus norvegicus 69
2.7.3 Гистологическое исследование 69
2.8 Статистическая обработка результатов 70
ГЛАВА 3. Результаты исследований 71
3.1 Получение, исследование размера и молекулярного состава мембранных везикул 71
3.1.1 Характеристика состава фракций, получаемых в процессе выделения мембранных везикул 71
3.1.2 Исследование размера и морфологии мембранных везикул полученных с помощью цитохалазина В 75
3.1.3 Исследование структуры актинового цитоскелета в клетках, обработанных цитохалазином В, и в мембранных везикулах 78
3.1.4 Исследование наличия генетического материала в составе мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В 80
3.1.4 Исследование процесса синтеза белка внутри мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В 82
3.2 Исследование взаимодействия и механизма доставки содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента 84
3.2.1 Исследование включения мембранного компонента везикул в состав цитоплазматической мембраны клетки-реципиента 84
3.2.2 Исследование переноса трансмембранных белков клетке-реципиенту посредством мембранных везикул 87
3.2.3 Исследование переноса содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента 92
3.3 Исследование проангиогенных свойств мембранных везикул, полученных от клеток, обладающих повышенной ангиогенной активностью 100
3.3.1 Исследование способности мембранных везикул индуцировать формирование капилляро-подобной сети эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro 100
3.3.2 Исследование молекулярного состава мембранных везикул на наличие проангиогенных факторов 103
3.3.3 Исследование способности мембранных везикул индуцировать ангиогенез in vivo 108
3.4 Оценка стабильности мембранных везикул мезенхимных стволовых клеток человека 114
ГЛАВА 4.Обсуждения результатов 119
Заключение 140
Выводы 144
Список сокращений 146
Список использованной литературы 148
