Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 19
1.1. Получение гомогенного стабилизированного препарата мембранных белков, в частности рецепторов класса GPCR, для исследования рентгеноструктурным анализом.
1.1.1. Экспрессионные системы для интегральных мембранных белков человека. 21
1.1.1.1. Экспрессия в E. coli 23
1.1.1.2. Экспрессия в других бактериальных штаммах 24
1.1.1.3. Экспрессия в дрожжевых системах 25
1.1.1.4. Экспрессия в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых 25
1.1.1.5. Экспрессия в бесклеточной системе 27
1.1.1.6. Экспрессия в клетках млекопитающих 28
1.1.1.7. Другие перспективные системы экспрессии 30
1.1.2. Стратегии стабилизации интегральных мембранных белков и подготовки их для рентгеноструктурного анализа 31
1.1.2.1. Описание использования химерных белков для стабилизации и получения структуры представителей класса GPCR з
1.1.2.2. Оптимизация детергента и стабилизирующее влияние липидной кубической фазы. Солюбилизация и выбор оптимального носителя для белка. 36
1.1.2.3. Другие методы стабилизации интегральных мембранных белков.
1.1.2.3.1. Стабилизирующее влияние лигандов 42
1.1.2.3.2. Антитела и нанотела 42
1.1.2.3.3. Кристаллизационные шапероны 43
1.1.2.3.4 Точечные мутации 43
1.2. Разработка современных биофизических технологий как ключевой фактор развития исследований ИМБ: автоматизация и миниатюризация 44
1.2.1. Создание методики кристаллизации нанолитрового масштаба в липидной кубической фазе LCP 45
1.2.2. Технологии исследования микрокристаллов ИМБ 50
1.3. Обзор по физиологии и фармакологии эндотелиновой системы. 53
1.3.1. Эндотелиновые рецепторы и их физиологическая роль 55
1.3.2. Физиологическая роль эндотелиновой системы человека 57
1.3.3. Современное состояние области разработки лекарственных средств, направленных на эндотелиновые рецепторы 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Материалы 63
2.1.1. Реактивы 63
2.1.2. Штаммы E.coli, использованные для генетической работы 63
2.1.3. Ферменты: 64
2.1.4. Плазмидные векторы 64
2.1.5. Питательные среды для роста бактериальных культур 64
2.1.6. Используемые клеточные культуры 65
2.1.7. Питательные среды для роста клеточных линий насекомых штамма sf9 65
2.1.8. Реагенты для трансфекции клеток насекомых 65
2.1.9.Реагенты для проточной цитофлюориметрии 65
2.1.10. Липиды и Детергенты: 65
2.1.11. Ингибиторы протеаз 66
2.1.12. Лиганды GPCR рецепторов 66
2.1.13. Хроматографические смолы и колонки 68
2.1.14. Антитела, мембрана и субстрат для иммуноблоттинга 68
2.1.15. Флуоресцентные красители 69
2.1.16. Концентрационные фильтры 69
2.1.17. Плашки и наборы для подбора кристаллизационных условий 69
2.1.18. Инструменты для извлечения кристаллов, петли 69
2.2. Методы 70
2.2.1. Получение генетических конструкций 70
2.2.1.1. Стандартные методики 70
2.2.1.2. Постановка ПЦР 70
2.2.1.3. Клонирование генетической конструкции в вектор pFastBac 71
2.2.1.4. Получение рекомбинантной бакмиды. 72
2.2.1.5. Трансфекция клеток насекомых бакмидной ДНК
2.2.2. Экспрессия GPCR рецепторов при помощи бакуловирусной системы экспресии в клетках насекомых 74
2.2.3. Измерение заражающего титра бакуловируса 74
2.2.4. Измерение уровня полной и поверхностной экспрессии 75
2.2.5. Получение изображения клеток при помощи конфокальной микроскопии 76
2.2.6. Измерение уровня жизнеспособности клеток 76
2.2.7. Получение клеточных мембран 77
2.2.8. Солюбилизация 77
2.2.9. Препаративная хроматографическая очистка GPCR рецепторов
2.2.10. Ферментативное дегликозилирование 79
2.2.11. Белковый гель-электрофорез и Вестерн-Блоттинг 79
2.2.12. Аналитическая гель-фильтрационная хроматография 80
2.2.13. Анализ термостабильности белка 80
2.2.14. Анализ подвижности молекул белка в липидной кубической фазе. 81
2.2.15. Кристаллизационные тесты 83
2.2.16. Методика визуализации кристаллов 84
2.2.17. Методика извлечения кристаллов из кристаллизационной пробы 84
2.2.18. Тестирование дифракционных свойств кристаллов на синхротроне 85
2.2.19. Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа. 85
2.2.20. Исследование кристаллизационных фаз методом малоугловой рентгеновской диффракцией (SAXD) 86
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 88
3.1. Отработка методологии исследования GPCR рецепторов на примере 2-адренергического рецептора 88
3.2. Эндотелиновый рецептор В.
3.2.1. Описание объекта исследования 92
3.2.2. Создание генно-инженерных конструкций 95
3.2.3. Исследования поверхностной экспрессии рецептора 106
3.2.4. Визуализация экспрессии методом конфокальной микроскопии 115
3.2.5. Стратегия солюбилизации и очистки рецептора 116
3.2.6. Использование лигандов 117
3.2.7. Масс-спектрометрический контроль 120
3.2.8. Анализ на термостабильность 122
3.2.9. Исследование подвижности рецептора в липидной кубической фазе при помощи методики FRAP
3.2.10. Тестирование формируемых липидных фаз методом малоуглового рентгеновского рассеяния. 133
3.2.11. Кристаллизационные испытания. 135
Заключение 137
Основные выводы работы 137
Опубликованные работы по теме диссертации 138
Благодарности 140
