Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика Bacteroides fragilis. Выявление энтеротоксигенных штаммов 12
1.2. Влияние BFT на эпителиальные клетки 16
1.3. Строение молекулы BFT. Механизмы созревания пробелка 19
1.4. Структурно-функциональный анализ BFT 25
1.5. Активность BFT по отношению к различным субстратам in vitro 27
1.6. ВFT-индуцированное расщепление Е-кадгерина 31
1.7. Взаимодействие BFT с поверхностью клеток эпителия 37
1.8. Другие эффекты воздействия BFT на эпителиальные клетки 39
1.9. Модель патогенеза заболеваний, вызываемых ETBF 42
2. Материалы и методы 45
2.1. Материалы 45
2.2. Штаммы E. coli и B. fragilis 45
2.3. Плазмиды 45
2.4. Линии клеток 45
2.5. Олигодезоксирибонуклеотиды 46
2.6. Полимеразная цепная рекция 48
2.7. Реакция рестрикции 48
2.8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 48
2.9. Реакция лигирования
2.10. Культивирование клеточных культур E. coli и трансформация их плазмидной ДНК 49
2.11. Выделение плазмидной ДНК 49
2.12. Определение нуклеотидной последовательности генома энтеротоксигенного изолята B. fragilis 49 2.13. Скрининг ДНК из образцов кала на наличие последовательностей, кодирующих BFT-1 и BFT-3 50
2.14. Получение фрагментов ДНК, кодирующих prBFT 1, 2 и 3 51
2.15. Конструирование экспрессионных векторов, кодирующих BFT, слитый с полигистидиновой последовательностью
2.15.1. Клонирование ДНК-фрагмента, кодирующего каталитический домен BFT-2 51
2.15.2. Клонирование ДНК-фрагментов, кодирующих prBFT-1, 2, 3 2.16. Конструирование плазмид, кодирующих prBFT-1, 2, 3 без полигистидиновых последовательностей 53
2.17. Сайт-направленный мутагенез 53
2.18. Конструирование плазмид, кодирующих потенциальные субстраты для BFT 2.18.1. Конструирование плазмид для получения Е-кадгерина в E. coli и культуре клеток человека Expi293F 55
2.18.2. Получение гена тиоредоксина с линкером, кодирующим предполагаемый сайт расщепления для BFT
2.19. Наработка рекомбинантных BFT 56
2.20. Выделение и процессинг рекомбинантных BFT, слитых с последовательностью из шести остатков гистидина 58
2.21. Выделение и процессинг рекомбинантных BFT, без последовательности из шести остатков гистидина 59
2.22. Определение N-концевой последовательности BFT-2 60
2.23. Гель-фильтрация 61
2.24. Получение рекомбинантного Е-кадгерина в E.coli 61
2.25. Получение рекомбинантного Е-кадгерина в Expi 293F 62
2.26. Получение фракций, обогащенных Е-кадгерином, из клеток линии НТ-29 62
2.27. Получение тиоредоксина с предполагаемым сайтом расщепления для BFT 64
2.28. Масс-спетрометрический анализ рекомбинантных белков 64
2.29. Определение концентрации белка 65
2.30. Получение поликлональных антител к рекомбинантным mBFT2-His и prBFT2-His 65
2.31. Тест активности BFT на клетках НT-29 66
2.32. Вестерн-блот гибридизация 67
2.33. Анализ жизнеспособности клеток HT-29 и индукции апоптоза после обработки mBFT-2 и prBFT-2 68
2.34. Определение протеолитической активности BFT in vitro 69
2.35. Исследование способности рекомбинантных prBFT к автопротеолизу 70
2.36. Сбор культуральной среды после обработки клеток линии НТ-29 белком mBFT-2 70
2.37. Пробоподготовка для проведения LC-MS анализа 71
2.38. LC-MS анализ 72
2.39. Анализ изменения количества белка в культуральной среде после обработки клеток линии НТ-29 белком mBFT2-His 74
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 75
3.1. Конструирование плазмид для регулируемой экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих prBFT 1, 2, 3 и каталитический домен BFT-2 75
3.2. Получение векторов для экспрессии гена, кодирующего Е-кадгерин, в E. coli и клетках линии Expi293F 79
3.3. Получение рекомбинантных BFT 80
3.4. Получение зрелых BFT из рекомбинантных пробелков 85
3.5. Выделение рекомбинантных Е-кадгеринов 88
3.6. Гель-фильтрация препаратов BFT 89
3.7. Определение нуклеотидной последовательности генома энтеротоксигенного изолята B. fragilis 91
3.8. Получение антител к BFT-2 92
3.9. Действие выделенных BFT на линию клеток НТ-29 94
3.10. Тестирование протеолитической активности рекомбинантных BFT с использованием желатина, азоколла, азоказеина и модифицированного тиоредоксина 98
3.11. Исследование способности рекомбинантных prBFT к автопротеолизу 100
3.12. Исследование Е-кадгерина в качестве потенциального субстрата для BFT 100
3.13. Влияние структуры цинк-связывающего мотива на активность BFT 101
3.14. Выявление белков, высвобождающихся в культуральную среду после обработки клеток НТ-29 mBFT2-His 103
4. Обсуждение результатов 107
Заключение 120
Выводы 122
Список сокращений 123
Список литературы 125
