Введение
1. Список сокращений. 5
2. Введение. 7
3. Обзор литературы. 10
1. Репродуктивно-респираторный синдром свиней. 10
2. Биологические характеристики вируса РРСС. 13
2.1. Морфология и физические свойства вируса. 13
2.1.1. Структура вириона вируса РРСС. 13
2.1.2. Структура генома вируса РРСС. 14
2.1.3. Вирусные белки. 15
2.1.4. Устойчивость к воздействию различных факторов. 21
2.1.5. Нуклеокапсидный белок. 21
2.2. Классификация вируса РРСС. 25
2.3. Гуморальный и клеточный иммунный ответ организма при инфекции вирусом РРСС. 25
2.4. Патогенез и патология РРСС. 26
2.5. Культивирование вируса РРСС. 31
2.6. Эпизоотология РРСС. 32
3. Меры борьбы и профилактики РРСС. 34
3.1. Неспецифическая профилактика РРСС. 34
3.2. Вакцинация против вируса РРСС. 36
4. Диагностика РРСС. 40
1 Заключение по обзору литературы. 44
2 Материалы и методы исследования. 46
3 Штаммы вируса РРСС, клеточные линии. 46
4 Моноклональные антитела. 46
5 Сыворотки. 46
6 Маркеры молекулярного веса. 47
7 Наборы.
8Ферменты. 47
9 Праймеры. 47
10 Плазмитдные векторы. 48
11 Выделение РНК из культуры клеток. 49
12 Проведение ОТ-ПЦР. 49
13 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 51
14 Очистка фрагментов ДНК в агарозном геле с Nal. 51
15 Рестрикция.
16 Лигирование.
17 Приготовление ростовых сред для Е.coli. 52
18 Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК и лигазными смесями. 52
19 Выделение плазмидной ДНК. 54
20 Определение нуклеотидных последовательностей и их анализ. 54
21 Индукция экспрессии гена ORF7. 54
22 Экспрессия гена ORF7 в культуре клеток насекомых. 55
23 Выделение рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rN) методом металлоаффинной хроматографии. 56
24 ДСН-ПААГ. 58
25 Иммуноблот. 58
26 Непрямой иммуноферментный анализ (ИФA) rN. 59
27 Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) антител к rN в сыворотках крови свиней. 59
28 Статистические расчеты и графики. 60
29 Результаты исследований. 61
5. Анализ сывороток из хозяйств России и республики Беларусь на присутствие антител к вирусу РРСС. 61
2. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в клетках насекомых. 61
2.1. Амплификация генов нуклеокапсидного белка (ORF7). 61
2.2. Получение рекомбинантных донорных плазмид для бакуловирусной системы экспрессии, несущих ген ORF7. 64
2.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7, кодирующих нуклеокапсидный белок. 64
2.4. Получение рекомбинантного бакуловирусного генома, несущего ген ORF7. 66
3. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в системе экспрессии в Е.соИ. 70
3.1. Амплификация генов нуклеокапсидного белка (ORF7). 70
3.2. Получение рекомбинантных экспрессионных плазмидных векторов для системы экспрессии в клетках Е.соИ, несущих гены ORF7. 70
3.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7. 70
3.4. Экспрессия генов нуклеокапсидных белков вируса РРСС американского и европейского типов вЕ.соїі.
4. Очистка и характеристика рекомбинантных нуклеокапсидных белков. 71
4.1. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из клеток насекомых. 73
4.2. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из Е.соИ. 74
4.3. Иммунохимический анализ рекомбинантных продуктов. 75
4.4. Определение оптимального количества рекомбинантных нуклеокапсидных белков для их использования в качестве антигенов в неппямом TRermorimwoM ИФА. непрямом твердофазном ИФА. 75
5. Сравнение антигенной активности рекомбинантных белков нуклеокапсида американского и европейского типов вируса РРСС и рекомбинантных белков одного типа, полученных в разных системах экспрессии, в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней. 77
6. Сравнение результатов применения рекомбинантных нуклеокапсидных белков в качестве антигена в непрямом ИФА с результатами применения коммерческой тест-системы фирмы IDEXX для анализа сывороток крови иммунных и неиммунных свней. 80
1. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней и оценка «отсекающего» значения коэффициента связывания (Ксв). 82
1.1. Определение отсекающего значения коэффициента связывания. 83
2. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с полевыми сыворотками. 84
7. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней и оценка «отсекающего» значения коэффициента связывания (Ксв). 84
1. Испытание разработанной тест-системы на широкой выборке полевых сывороток. 85
2. Обсуждение. 86
Выводы. 100
