Введение
1. Обзор литературы. 9
1.1 Общая характеристика рака предстательной железы 9
1.1.1 Эпидемиология рака предстательной железы 9
1.1.2 Этиология рака предстательной железы и факторы риска. 9
1.1.3 Заболевания простаты и патофизиология рака предстательной железы. 10
1.1.4. Диагностика рака предстательной железы на сегодняшний день. 12
1.1.5. Классификация РПЖ по шкале Глисона и системе TNM 14
1.1.6. Локализованные опухоли и агрессивный РПЖ: прогноз и лечение . 17
1.2 Использование простатспецифического антигена в качестве биомаркера рака предстательной железы: проблемы и направления исследований. 20
1.2.1 Виды биомаркеров, наиболее востребованных в контексте РПЖ. 20
1.2.2 Проблемы использования простатспецифического антигена в качестве биомаркера рака предстательной железы. 22
1.2.2.1 Нижняя граница нормы и чувствительность ПСА как биомаркера. 22
1.2.2.2 Специфичность ПСА как биомаркера. 22
1.2.2.3 Скрининг РПЖ с помощью ПСА и проблема «ненужных» биопсий 25
1.2.3. Модификации анализа на ПСА 26
1.2.3.1 Плотность ПСА. 26
1.2.3.2 Скорость нарастания уровня ПСА. 27
1.2.3.3 Свободный ПСА. 28
1.2.3.4 Изоформы ПСА. 29
1.2.3.5 Индекс здоровья простаты. 30
1.2.3.6 Калликреиновая панель 4KScore. 32
1.3. Потенциальные РНК-биомаркеры рака предстательной железы 34
1.3.1 РНК биомаркеры для неинвазивной диагностики, детектируемые в моче пациентов с РПЖ. 36
1.3.1.1 PCA3 36
1.3.1.2 TMPRSS2-ERG. 37
1.3.1.3 Mi-Prostate score 38
1.3.1.4 ExoDx Prostate Intelliscore. 39
1.3.1.5 SelectMDx. 40
1.3.2 Тканевые РНК маркеры и прогностические экспрессионные панели. 41
1.3.2.1 Oncotype Dx. 42
1.3.2.2 Prolaris. 43
1.3.2.3 Decipher. 44
1.3.3 Некодирующий транскриптом как перспективная область поиска биомаркеров РПЖ. 46
1.3.3.1 Длинные некодирующие РНК 46
1.3.3.2 МикроРНК . 49
1.3.3.3 Другие малые некодирующие РНК. 52
2. Материалы и методы. 54
2.1 Материалы 54
2.1.1 Образцы тканей предстательной железы. 54
2.1.2 Образцы мочи и плазмы крови. 55
2.1.3. Данные проекта TCGA 56
2.2. Методы. 56
2.2.1 Выделение РНК. 56
2.2.2 Удаление примесей ДНК. 56
2.2.3 Оценка количества и качества РНК 56
2.2.4 Деплетирование рРНК. 56
2.2.5 Фрагментация РНК 57
2.2.6 Фосфорилирование 5 -концов РНК. 57
2.2.7 Чистка РНК 57
2.2.8 Чистка кДНК. 57
2.2.9 Нормализация кДНК с помощью дуплекс-специфичной нуклеазы 58
2.2.10 Приготовление транскриптомных библиотек для высокопроизводительного секвенирования. 58
2.2.11 Приготовление библиотек фрагментов кДНК. 59
2.2.12 Высокопроизводительное секвенирование РНК-библиотек. 59
2.2.13 Первичный анализ транскрипционного состава полученных при секвенировании профилей экспрессии. 59
2.2.14 Сравнение экспрессионных профилей методом многомерного шкалирования 60
2.2.15 Анализ дифференциальной экспрессии генов. 61
2.2.16 Анализ данных проекта TCGA. 62
2.2.17 Поиск обогащенных сайтов связывания ТФ и микроРНК. 62
2.2.18 Постановка ОТ-ПЦР в реальном времени 63
2.2.19 Анализ результатов ОТ-ПЦР в реальном времени. 64
3. Результаты и обсуждение. 65
3.1 Поиск потенциальных биомаркеров РПЖ в ткани предстательной железы. 66
3.1.1 Адаптация метода приготовления библиотек на основе РНК из FFPE блоков. 67
3.1.1.1 Выделение РНК. 68
3.1.1.2 Удаление ДНК. 69
3.1.1.3 Фрагментация РНК 69
3.1.1.4 Чистка образца РНК. 74
3.1.1.5 Деплетирование рибосомальной РНК. 75
3.1.1.6 Лигирование адаптеров и построение кДНК 77
3.1.1.7 Амплификация кДНК. 78
3.1.1.8 Итоговая версия протокола. 78
3.1.2. Секвенирование транскриптомных библиотек на основе РНК из FFPE-блоков и первичный анализ данных. 79
3.1.2.1 Анализ состава и глубины полученных транскрипционных профилей. 80
3.1.2.2 Кластеризация образцов и формирование конечной выборки . 81
3.1.3 Поиск тканевых РНК-биомаркеров РПЖ 84
3.1.3.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов 85
3.1.3.2 Сравнение полученных результатов с данными проекта TCGA. 86
3.1.3.3 Валидация результатов, полученных методом RNA-Seq, с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. 88
3.1.3.4 Поиск новых регуляторных элементов, подавляющих экспрессию генов в опухолевой ткани простаты при РПЖ. 90
3.2. Скрининг кандидатных биомаркеров РПЖ в моче и плазме пациентов с РПЖ и ДГПЖ. 92
3.2.1. Адаптация метода приготовления кДНК-библиотек на основе РНК из мочи и плазмы крови 94
3.2.2. Адаптация метода приготовления транскриптомных библиотек на основе РНК из мочи и плазмы крови. 99
3.2.3. Анализ данных секвенирования полученных библиотек и поиск потенциальных биомаркеров РПЖ 101
3.2.4 Нормализация транскриптомных библиотек на основе РНК из мочи плазмы крови 103
3.2.5. Анализ данных секвенирования нормализованных транскриптомных библиотек и обнаружение потенциальных биомаркеров РПЖ 104
Заключение. 107
Выводы. 108
Благодарности. 109
Список литературы 110
Приложение А. 140
Приложение Б 141
Приложение В 143
