Введение
1 Обзор литературы 7
1. Приоиы млекопитающих 7
1.1. История открытия прионного белка PrPSc 7
1.2. Доказательства прионных свойств белка PrPlt: 8
1.3. Свойства белка РгРс и его прионной изоформы PrP с 9
1.4. Молекулярные механизмы прионного перехода 10
1.5. Существование межвидового барьера. Штаммы приоиов 11
2. Амилоиды и амилоидозы 13
2.1. Амилоидозы человека 13
2.2. Структура амилоидных фибрилл 16
2.3. Любой ли белок может стать амилоидом 17
2.4. Чем обусловлено различие в иифекционности прионов и амилоидов 18
3. Прионы низших эукариот 20
3.1. Цитоплазматический детерминант [HET-s] гриба Podospora anserina 21
3.2. Нехромосомный детерминант [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae 22
3.3. Детерминант [Р5Ґ]: генетические проявления и молекулярная основа 23
3.3.1. Доказательства прионных свойств Sup35. Изучение прионного перехода белка Sup35 in vitro 24
3.3.2. Структура и функции белка Sup35 26
3.3.3. Приониый домен Sup35: роль аминокислотного состава и олигопептидных повторов в определении прионных свойств 27
3.3.4. Двухуровневая структура прионных агрегатов Sup35 28
3.4. Нехромосомный детерминант [РЛ^Ґ] дрожжей Saccharomyces cerevisiae 29
3.5. Роль inanepoi-raHspl04 в поддержании [PSf] 31
3.6. Варианты [PSf] 33
3.7. Феномен мультикопийной супрессии 34
4. Исследование болезни Хантингтона в дрожжевой системе 35
4.1. Факторы, влияющие на агрегацию полиглутаминовых белков 36
4.1.1. Зависимость агрегации от экспрессии и количества остатков глутамина 36
4.1.2. Взаимодействие шаперонов с полиглутаминовыми белками 36
4.1.3. Способность прионных и амилоидных белков инициировать полимеризацию гетерологичных белков 38
5. Биологическое значение и распространенность в природе прионов и амилоидов 44
6. Заключение. Постановка задачи исследования 48
2 Материалы и методы 50
1. Среды, штаммы, условия культивирования 50
2. Генетические методы. Трансформация микроорганизмов 54
3. Конструирование плазмид и другие генно-инжеиериые манипуляции 57
4. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов в клетках дрожжей бб
5. Флуоресцентная микроскопия 67
6. Экспрессия в Е. соїі и аффинная очистка белка -Rnql-Hise 68
7. Получение и очистка антител к белку Rnql 69
8. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 70
9. Белковый гель-электрофорез, иммуиоблоттинг 71
10. Прионный переход белка Sup35 in vitro 73
11. Выделение амилоидных полимеров белка Sup35 73
3 Результаты 75
1. Изучение амилоидного состояния белка SUP35 75
1.1. Большая часть белка Sup35 при его сверхпродукции в клетках [psf^PIN*] находится в амилоидной форме 75
1.2. Полимеры белка Sup35 содержат Rnql 84
1.3. Агрегация белка Sup3 5 приводит к супрессии нонсенс-мутаций 87
2. Изучение прионных и амилоидных свойств гибридных полиглутаминовых белков 92
2.1. Полимеризация гибридного белка Q66-Sup35MC ненаследуема 92
2.2. Полиглутаминовые и полиглутамин/тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуются in vivo 96
2.3. Влияние inanepOHaHspl04 на полимеризацию гюлиглутаминовых белков 102
2.4. Способность белков polyQ к полимеризации в клетках ArnqJ зависит от длины полиглутаминовой последовательности 105
2.5. Кополимеризация полиглутамин-содержащих белков с другими глутамин-богатыми белками 111
4 Обсуждение 116
1. Свойства неприонных амилоидов белка Sup35 116
2. Белки polyQ и polyQY эффективно образуют полимеры in vivo 119
3. Полимеры белков polyQ фрагментируются и могут быть прионами 122
4. Добавление тирозиновых остатков улучшает фрагментацию полиглутаминовых полимеров 124
5. Фрагментация полимеров polyQY в отсутствие Hspl04 125
6. Взаимное ускорение полимеризации между различными амилоидогенными белками 127
7. Межвидовой барьер в передаче прионного состояния 130
8. Прионы и неприогшые амилоиды: два типа наследования (поддержания) 131
Заключение 134
Выводы 137
