Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Интерферон. Общие сведения 11
1.2. Структура интерферона альфа-2 13
1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2 16
1.4. Активация синтеза интерферона в клетках 17
1.5. Рецепторы интерферона альфа 17
1.6. Сигналы, вызванные дейс твием интерферона на клетку 20
1.7. Клиническое применение интерферона
1.7.1. Общая информация 23
1.7.2. Терапия хронического гепатита В 23
1.7.3. Терапия хронического гепатита С 24
1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии 24
1.7.5. Терапия саркомы Капоши
1.8. Требования качества к интерферон - содержащим препаратам 25
1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа
1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным дейст- 28
вием
1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул 28
1.10.2. Пегилирование. Общая информация 30
1.10.3. Химия пегилирования
1.10.3.1. Активированные ПЭГ первого поколения 34
1.10.3.2. Активированные ПЭГ второго поколения
1.10 3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации аминогрупп
1.10 3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 39
пистеинов 1.10.
3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации 40
окисленных карбогидратов 1.10.
3.3. Реверсивное пегилирование 41
1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ
1.10.4. Структура активированных ПЭГ 43
1.10.5. Влияние пегилирования на физико - химические и 43 биологические свойства белковых молекул
1.10.5.1. Влияние на гидрофильноеть, молекулярный вес и гидродина- 44 мический радиус 1.10.5.2. Влияние на конформацию 44
1.10.5.3. Влияние на заряд
1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов 46
1.10.7. Токсичность ПЭГ 47
1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пегилированных белков
1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродинамическом радиусе 1.10.8.2. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидрофильности
1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде молекулы 1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в медици- 54
не 1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 - различные стратегии... 55
1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2Ь (ПЕГИНТРОН) 57
1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС) 60
2. Собственные исследования 65
2.1. Материалы и методы исследований 65
2.1.1. Материалы 65
2.1.2. Аналитические методы
2.1.2.1. Гельфильтрапия на сорбенте Superose 12 66
2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте TSKgel SP-5PW 66
2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии 67
2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях) с окраской нитратом серебра
2.1.2.5. Определение специфической активности 68
2.1.3. Препаративные методы 68
2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона альфа
2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-2 69
2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF
2.1.3.4. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30
2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF
2.1.3.6. Перевод очищенного интерферона альфа-2 в буфер хранения 71 методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Superdex 75.
2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь 71
2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а 72
2.1.3.9. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа- 2Ь
2.1.3.10. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа2а
2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона альфа-2 на сорбенте MacroCap SP
2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона альфа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии
на сорбенте Sephadex G25
2.2. Результаты и обсуждение 75
2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферо- 75
на альфа-
2 2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерферона альфа
2.2.1.2. Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих агентов на процесс ренатурации
2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации... 80
2.2.1.4. Исследование влияния ионной силы раствора, концентрации хаотропного агента и значения рН на процесс ренатурации
2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на процесс ренатурации
2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на ренатурапионный буфер
2.2.1.7. Определение оптимальной продолжительности процесса ренатурации 2.2.1.8. Масштабирование оптимизированного процесса ренатурации... 87
2.2.2. Разработка технологии очистки интерферона альфа-2 88
2.2.2.1. Разработка стадии предварительной очистки интерферона альфа-
2 2.2.2.2. Разработка стадии тонкой очистки интерферона альфа-2 91
2.2.2.3. Стадия концентрирования интерферона альфа-2 96
2.2.2.4. Стадия перевода интерферона альфа-2 в буфер хранения 97
2.2.3. Разработка технологии пегилирования и дальнейшей очистки интерферона альфа-2а и альфа-2Ь
2.2.3.1. Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь 101
2.2.3.1.1. Оптимизация значения рНреакционного буферного раствора.. 103
2.2.3.1.2. Исследование кинетики реакции пегилирования интерферона 105 альфа-2Ь, определение оптимальной температуры
2.2.3.1.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 107 ния
2.2.3.1.4. Оптимизация соотношения белок - ПЭГ в реакционном буфере
2.2.3.1.5. Определение оптимальной концентрации интерферона альфа-2Ь в реакционном буфере 2.2.3.2. Разработка технологии очистки монопегилированного безме- 112
тионинового интерферона альфа-2Ь
2.2.3.2.1. Очистка методом тангенциальной фильтрации 112
2.2.3.2.2. Очистка пегилированного интерферона альфа-2 методом гельфильтрации
2.2.3.2.3. Очистка методом гидрофобной хроматографии 114
2.2.3.2.4. Очистка монопегилированного интерферона альфа-2Ь методом катионообменной хроматографии
2.2.3.2.5. Концентрирование монопегилированного интерферона альфа- 2Ь
2.2.3.2.6. Перевод монопегилированного интерферона альфа-2Ь в буфер хранения
2.2.3.2.7. Сравнение полученного препарата монопегилированного интерферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегинтрон
2.2.3.3. Разработка технологии пегилирования интерферона альфа-2а... 123
2.2.3.3.1. Влияние значения рН на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
2.2.3.3.2. Изучение кинетики процесса пегилирования интерферона альфа-2а, определение оптимальной температуры процесса
2.2.3.3.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирования
2.2.3.3.4. Исследование влияния концентрации интерферона на процесс 128 пегилирования
2.2.3.3.5. Определение оптимального соотношения белок - ПЭГ 129
2.2.3.3.6. Изучение влияния структуры растворителя на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
2.2.3.4. Разработка технологии очистки монопегилированного интерферона альфа-2а
2.2.3.5. Сравнение полученного препарата монопегилированного интерферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегасис
2.2.4. Масштабирование технологии получения субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, валидапия процессов
2.2.5. Исследование стабильности полученных препаратов пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь
2.2.6. Экономическая эффективность процесса производства пегилированных форм интерферона
3.Выводы 141
4. Практическое использование полученных результатов
5. Рекомендации по использованию научных
Выводов 6.
Список использованной литературы
