ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………….……... 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………….… 12
1.1 Рак предстательной железы…………………………………………………………….…….….12
1.2 Микроокружение опухоли и его роль в прогрессии заболевания……………………..……... 13
1.3 Макрофаги и их биологические функции……………………………………………………... 16
1.4 Фенотипы макрофагов…………………………………………………………………..………. 18
1.5 Цитотоксическая активность макрофагов……………………………………………..………. 19
1.6 Фагоцитоз………………………………………………………………………………...………. 21
1.7 Роль цитотоксической активности макрофагов в онкогенезе………………………………... 23
1.8 Макрофаги, ассоциированные с опухолью……….……………………………………………. 24
1.9 Макрофаги, ассоциированные с опухолью
как мишень противоопухолевой терапии……………………………………………………..…… 26
1.9.1 Ингибирование инфильтрации моноцитов ……..……………………………………….… 29
1.9.2 Элиминация макрофагов, ассоциированных с опухолью …...…………………...………. 30
1.9.3 Реполяризация макрофагов, ассоциированных с опухолью……………………………… 31
1.10 Заключение…………………………………………………………………………..………. 34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………………………………. 36
2.1 Материалы……………………………………………………………………………….………. 36
2.1.1 Клеточные линии…………………………………………………………………...…………. 36
2.1.2 Реагенты и среды……………………………………………………………………………… 37
2.1.3 Список используемых растворов…………………………………………………………….. 39
2.2 Клеточная модель для получения опухолевых клеток,
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов……………………………………….… 40
2.2.1 Подбор рабочих концентраций факторов дифференцировки
миелоидных клеток линии THP-1, HL-60, U937 и K562………………………………..………… 41
2.2.2 Оценка уровня продукции провоспалительных цитокинов
макрофагов в модели…………………………………………………………………….……...…... 41
2.2.3 Оценка устойчивости опухолевых клеток
к цитотоксической активности макрофагов…………………………………………….…….…… 42
2.3 Функциональный анализ усточйчивых сублиний опухолевых клеток in vitro……………… 42
2.3.1 Анализ пролиферативной активности……………………………………………….….….… 42
2.3.2 Тест на образование колоний
в условиях разреженной популяции……………………………………………………….……..… 43
3
2.3.3 Тест на миграционную способность по градиенту ростовых факторов…………………… 43
2.3.4 Анализ чувствительности опухолевых клеток к действию
цитостатиков …………….………………………………………………………………….……….. 43
2.4 Анализ ферментативной активности желатиназ……………………………………….……… 44
2.5 Приготовление белковых лизатов клеток………………………………………………....…… 44
2.6 Вестерн-блот анализ……………………………………………………………………….……. 45
2.7 Оценка роста опухоли in vivo…………………………………………………………….….…. 46
2.8 Гистология и иммуногистохимия………………………………………………………...……. 46
2.8.1 Приготовление срезов………………………………………………………………….…..…. 46
2.8.2 Гистологическое окрашивание……………………………………………………….……… 46
2.8.3 Иммуногистохимическое окрашивание…………………………………………….………. 47
2.9 Иммуноцитохимия……………………………………………………………………….….….. 48
2.9.1 Подготовка клеточной культуры………………………………………………………...…... 48
2.9.2 Процедура исследования …………………………………………………………………..… 48
2.9 Выделение тотальной РНК……………………………………………………………..……… 49
2.10 Обратная транскрипция…………………………………………………………………….…. 49
2.11 Полимеразная цепная реакция
в режиме реального времени…………...………………………...…………………………….…. 50
2.12 Электрофорез ДНК в агарозном геле…………………………………………………...…… 51
2.13 Секвенирование транскриптома…………………………………………………………..…. 51
2.13.1 Приготовление библиотек кДНК………………………………………………………..… 51
2.13.2 Анализ данных секвенирования…………………………………………………………… 51
2.14 Статистическая обработка результатов…………………………………………………...… 52
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………………..……. 53
3.1 Оценка цитотоксической активности макрофагоподобных клеток,
полученных в результате дифференцировки THP-1, HL-60, K562 и U937……………………..53
3.2 Оценка цитотоксической активности макрофагоподобных клеток,
полученных в результате дифференцировки THP-1 и HL-60 в модели………………….…….. 54
3.3 Получение опухолевых клеток,
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов…………………………………..…… 55
3.4 Сравнение устойчивости исходных и сублиний
опухолевых клеток к цитотоксической активности макрофагов………………………...…….. 56
3.5 Исследования in vivo……………………………………………………………………..…..… 57
3.6 Анализ транскриптома……………………………………………………………….…….….. 60
3.7 Функциональный анализ сублиний опухолевых клеток,
4
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов in vitro………………………….….…74
3.7.1 Исследование способности клеток формировать колонии
в условиях разреженной популяции………………………………………………………….….… 74
3.7.2 Исследование динамики роста………………………………………………………….…..… 73
3.7.3 Анализ миграционной активности……………………………………………………...…… 75
3.7.4 Анализ уровня секреции матриксных металлопротеиназ ……...………………….…….… 77
3.7.5 Исследование активности белков, потенциально вовлеченных
в формирование устойчивости………….…………………………………………………..…….... 78
3.7.6 Анализ чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатиков……….....…… ...80
3.7.7 Результаты иммуноцитохимического анализа…………………………………..…..…….. ...80
3.8 Исследование фенотипа стромальных иммунокомпетентных клеток
рака редстательной железы…………………………………………………………………...….…. 85
3.8.1 Экспрессия AMACR, p63 и Ki-67……………………………………………………...…….. 87
3.8.2 Экспрессия маркеров Т-клеток
в строме опухоли рака предстательной железы……………………………………………..….… 87
3.8.3 Экспрессия маркеров макрофагов
в строме опухоли рака предстательной железы………………………………………...…..….…. 90
3.8.4 Экспрессия маркеров нейтрофилов и В-лимфоцитов в ткани
рака предстательной железы…………………………………………………………….......….….. 95
3.8.5 Экспрессия PD-L1, IDO1 и TNF в опухоли предстательной железы…………...….….….. 96
3.8.6 Корреляционный анализ клеточного состава стромы
опухолей рака предстательной железы……………………………………………………......…. 100
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………………………...…....102
4.1 Получение опухолевых клеток,
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов in vitro……………………..……....….102
4.2 Функциональные характеристики опухолевых клеток,
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов……………………………….…….… 104
4.3 Характеристики транскриптома опухолевых клеток,
устойчивых к цитотоксической активности макрофагов………………………………….….… 108
4.4. Особенности фенотипа клеток воспалительного инфильтрата
опухолевой стромы рака предстательной железы и их клиническая значимость………….…..112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………….………. 114
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………...……. 116
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ………………….………….….. 117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………………….. 120
