Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. современные методы идентификации возбудителей особо опасных микозов
1.1 Таксономическое положение и биология возбудителей особо опасных микозов 13
1.2 Патогенез заболеваний и факторы вирулентности возбудителей особо опасных микозов 20
1.3 Лабораторная диагностика особо опасных микозов 23
1.4 Молекулярно-генетические методы исследования возбудителей особо опасных микозов 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1 Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования 36
2.2 Проведение культурально-морфологического исследования чистых культур микромицетов 39
2.3 Использование тест-системы AUXACOLOR 2 для изучения биохимической активности возбудителей особо опасных микозов 40
2.4 Подготовка биологического материала для ПЦР-анализа 40
2.5 Выделение ДНК микромицетов для использования в молекулярно-генетических методах анализа
2.5.1 Метод гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом 42
2.5.2 Метод гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с нуклеосорбцией
2.6 Полимеразная цепная реакция с электрофорезной детекцией 43
2.7 Подбор праймеров и флуоресцентных зондов для ПЦР в реальном времени 44
2.8 Реакция амплификации в режиме реального времени 45
2.9 Секвенирование продуктов амплификации и анализ полученных нуклеотидных последовательностей 45
2.10 Заражение лабораторных животных 46
2.11 Статистическая обработка данных 47
ГЛАВА 3. Идентификация возбудителей кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза и бластомикоза на основе культурально-морфологических и биохимических признаков 48
3.1 Культурально-морфологические особенности возбудителей кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза и бластомикоза 48
3.2 Изучение возможности идентификации возбудителей особо опасных микозов с помощью колориметрической тест-системы AUXACOLOR II 51
ГЛАВА 4. Конструирование амплификационной тест системы с детекцией результатов в режиме реального времени для выявления днк возбудителя бластомикоза 58
4.1 Подбор и анализ праймеров и гибридизационных олигонуклеотидных зондов для детекции Blastomyces dermatitidis 58
4.2 Оптимизация условий для постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на препаратах ДНК штаммов возбудителя бластомикоза 67
4.3 Анализ чувствительности и специфичности сконструированных праймеров и зондов для обнаружения возбудителя бластомикоза 69
4.4 Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителя бластомикоза при экспериментальной инфекции 73
ГЛАВА 5. Идентификация штаммов возбудителей особоопасных микозовспомощьюсеквенированияднк 79
5.1 Секвенирование нуклеотидных последовательностей музейных штаммов возбудителей особо опасных микозов с помощью видоспецифических праймеров 79
5.2 Секвенирование нуклеотидных последовательностей музейных штаммов микромицетов II-IV гр. патогенности с помощью коммерческого набора для секвенирования ДНК микромицетов D2LSU Kit 81
5.3 Секвенирование гена рибосомального белка L23 возбудителей кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза и бластомикоза 85
5.4 Секвенирование гена 28S рРНК штаммов возбудителей глубоких микозов и анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей 91
Заключение 99
Выводы 106
Список сокращений 108
Список литературы 109
