Введение
1. Обзор литературы. 9
1.1. Получение и использование трансгенных животных. 9
1.1.1. . Методы переноса генов 9
1.1.1.1. Перенос генов посредством микроинъекции ДНК 9
1.1.1.2. Транспорт ДНК с использованием ретровирусных векторов. 12
1.1.1.3. Пересадка ядер транфецированных генами. 14
1.1.1.4. Использование сперматозоидов в качестве векторов экзогенного ДНК. 14
1.1.2. Экспрессия генов. 15
1.1.3. Области применения транспорта генов. 19
1.1.3.1. Рост и развитие животных. 19
1.1.3.2. Получение молока с желаемыми свойствами. 2
1.1.3.3. Повышение качества и выхода шерсти у овец. 22
1.1.3.4. Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к инфекционным заболеваниям. 23
1.1.3.5. Биологическое моделирование патологических состояний человека. 26
1.1.3.6. Создание трансгенных животных - доноров органов для трансплантации человеку. 27
1.1.3.7. Трансгенные животные - продуценты биологически активных веществ медицинского назначения и для перерабатывающей промышленности. 29
1.1.3.8. Выбор вида для получения трансгенных животных 3 7
1.1.3.9. Кролик, как продуцент гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) 39
1.1.3.10. Биология, функция методы получения и применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) 40
2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Объекты исследования 49
2.2. Генные конструкции 49
2.3. Подбор доноров и реципиентов 53
2.4. Схема гормональной подготовки доноров 54
2.5. Синхронизация овуляции у реципиентов. 54
2.6. Методика извлечения зигот у кроликов. 56
2.7. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена. 58
2.8. Пересадка микроинъецированных эмбрионов 61
2.9. Методика получения вазектомированных самцов кроликов. 63
2.10. Получение и выращивание крольчат. 64
2.11. Молекулярно-генетический анализ 64
2.11.1. Выделение геномной ДНК и анализ интеграции. 64
2.11.2. Полимеразная цепная реакция 68
3. Результаты исследований. 71
3.1. Изучение возможности применения нового способа транспорта гена после инъекции в цитоплазму зиготы. 71
3.1.1. Сравнительная оценка разных способов стимуляции суперовуляции. 72
3.1.2. Влияние микроинъекции на развитие эмбрионов in vitro. 74
3.1.3. Эффективность трансплантации микроинъецированных эмбрионов. 75
3.1.4. Анализ интеграции трансгена 77
3.2. Получение трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колонестимулирующего фактора (ГКСФ). 78
3.2.1. Изучение ряда факторов на эффективность стимуляции суперовуляции и получение эмбрионов и потомков. 78
3.2.2. Изучение влияния разных способов извлечения зигот кроликов н выход эмбрионов. 81
3.2.3. Изучение качества извлеченных зигот и яйцеклеток после стимуляции суперовуляции у кроликов. 83
3.2.4. Изучение качества микроинъецированных эмбрионов кроликов при культивировании in vitro. 84
3.2.5. Изучение эмбриональных потерь в плодный период у кроликов после введения микроинъецированных зигот. 85
3.2.6. Изучение влияния возраста пронуклеуса на эффективность интеграции гена. 87
3.2.7. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов с введением gl GCSF в зиготу. 89
3.2.8. Изучение интеграции генной конструкции gl GCSF в плодах кроликов после пересадки микроинъецированных зигот. 93
4. Обсуждение результатов исследований. 96.
5. Выводы. 105
6. Практические предложения. 108
7. Литература. 109
