Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Промоторы генов растений 13
1.1.1. Типы промоторов 13
1.1.2. Охарактеризованные промоторы томата 20
1.2. Способы получения безмаркерных трансгенных растений 25
1.2.1. Позитивная селекция 27
1.2.2. Котрансформация 32
1.2.3. Удаление маркерных генов с помощью транспозонов 33
1.2.4. Удаление маркерных генов с помощью рекомбиназ 35
1.3. Суперсладкий белок тауматин и его использование в биоинженерии растений 37
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Растительный материал 40
2.1.1. Томат 40
2.1.2. Яблоня 40
2.2. Создание бинарных векторов 41
2.2.1. Бинарные векторы с новым промотором гена ELIP томата 41
2.2.2. Бинарные векторы для создания безмаркерных растений 41
2.3. Агробактериальная трансформация растений 44
2.3.1. Трансформация томата 44
2.3.2. Трансформация яблони 45
2.4. Функциональный анализ промотора гена ELIP томата 45
2.4.1. Отбор трансгенных растений томата с геном gusA 45
2.4.2. Анализ последовательности промотора ELIP 46
2.4.3. Гистохимическое окрашивание GUS 46
2.4.4. Экстракция белка и флюориметрический анализ GUS 47
2.5. Создание безмаркерных растений томата 47
2.5.1. Подбор концентрации 5-фторцитозина для отрицательного отбора безмаркерных растений 47
2.5.2. Селекция безмаркерных растений томата 48
2.6. Создание безмаркерных растений яблони 49
2.7. Молекулярно-биологический анализ полученных растений 49
2.7.1. ПЦР-анализ растений томата 49
2.7.2. ПЦР-анализ растений яблони 50
2.7.3. Саузерн-блот анализ 51
2.8. Оценка экспрессии перенесенных генов 52
2.8.1. Качественная полимеразная цепная реакция томата, сопряженная с обратной транскрипцией 52
2.8.2. Полуколичественная ОТ-ПЦР яблони 52
2.8.3. Вестерн-блот анализ 53
2.8.4. Количественная оценка накопления тауматина в растениях томата 54
2.8.5. Анализ накопления тауматина в растениях яблони методом ПЦР в реальном времени 55
Глава 3. Результаты 56
3.1. Клонирование и анализ промотора ELIP томата 56
3.1.1. Клонирование и анализ последовательности промотора ELIP 56
3.1.2. Гистохимический анализ активности GUS в различных органах томата 65
3.1.3. Гистохимический анализ активности GUS в плодах томата 68
3.1.4. Количественный анализ активности GUS в плодах томата 70
3.2. Создание безмаркерных растений томата 72
3.2.1. Конструирование бинарного вектора 72
3.2.2. Получение безмаркерных линий с применением стратегии быстрой селекции 73
3.2.3. Получение стабильных трансгенных растений томата и ПЦР-анализ 77
3.2.4. Активация рекомбиназы и получение безмаркерных растений 81
3.2.5. Молекулярно-биологический анализ трансгенных и безмаркерных линий томата 83
3.3. Создание безмаркерных растений яблони 88
3.3.1. Конструирование бинарного вектора 88
3.3.2. Трансформация яблони и анализ переноса генов 88
3.3.3. Селекция безмаркерных растений яблони 88
3.3.4. Молекулярно-биологический анализ безмаркерных растений яблони 91
3.3.5. Анализ экспрессии перенесенных генов методом ОТ-ПЦР 93
3.3.6. Анализ экспрессии целевого гена методом ПЦР в реальном времени 95
Глава 4. Обсуждение 99
4.1. Клонирование и анализ промотора ELIP томата 99
4.2. Получение безмаркерных растений томата 105
4.3. Получение безмаркерных растений яблони 110
Заключение 116
Выводы 119
Список сокращений и условных обозначений 121
Список литературы 123
