Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации. 12
1.1.1. Общая характеристика аденовирусов человека. 13
1.1.2. Векторы на основе аденовирусов человека. 15
1.1.3. Особенности структурно-функциональной организации аденовируса птиц CELO. 20
1.1.4. Векторы на основе аденовируса птиц CELO. 25
1.2. Факторы роста кровеносных сосудов. 29
1.2.1. Ангиогенин. 3 0
1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина. 30
1.2.1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации. 33
1.2.1.3. Внутриклеточные функции ангиогенина 36
1.2.1.4. Другие функции белка. 38
1.2.2. VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). 40
1.2.2.1. Свойства и функции белка. 40
1.2.2.2. VEGF А. 43
1.2.2.3. Другие члены семейства VEGF. 45
1.2.2.4. Исследование способности VEGF индуцировать ангиогенез в организме животных и человека. 47
1.2.3. Другие факторы роста кровеносных сосудов. 50
2. Материалы и методы 54
2.1. Материалы. 54
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы. 54
2.1.2. Клеточные линии. 54
2.1.3. Плазмидные векторы. 54
2.1.4. Ферменты и другие реактивы. 55
2.1.5. Животные. 55
2.2. Методы . 55
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК. 55
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. 56
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами. 57
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. 57
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. 57
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК. 58
2.2.7. Трансформация клеток E.coli. 58
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 58
2.2.9. Полимеразная цепная реакция. 59
2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов. 60
2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов. 60
2.2.12. Накопление вирусов. 61
2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов. 61
2.2.14. Титрование вирусов. 62
2.2.15. Выделение вирионной ДНК. 62
2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом. 63
2.2.17. Трансфекция хорио-аллантоисной мембраны. 64
2.2.18. Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы. 64
2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS). 65
2.2.20. Иммуноблоттинг (Western blot immunoassay). 65
2.2.21. Хирургические манипуляции с лабораторными животными. 66
2.2.22. Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки. 66
2.2.23. Гистологический анализ. 67
2.2.24. Определение логфазы для микроорганизмов. 68
2.2.25. Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов. 68
3. Результаты исследований 70
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа. 70
3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены ANG и VEGF. 70
3.1.2. Анализ экспрессии генов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных векторах. 71
3.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток. 76
3.1.4. Детекция экспрессии генов ANG и VEGF в культуре клеток, зараженных рекомбинантными аденовирусами CELO-ANG и CELO- VEGF. 84
3.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. 86
3.2.1. Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов. 86
3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов 88
3.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина. 93
Выводы 114
